目的:探究沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)通过调控骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化与H型血管生成对老年骨质疏松状态下骨缺损愈合的作用,并探讨其具体分子机制.方法:利用免疫组织化学染色检测小鼠骨组织中SIRT1表达的增龄性改变.使用SIRT1激活剂SRT1720与抑制剂EX527作用于BMSCs,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)与Western blot检测成骨标志物以及促H型血管形成因子的表达变化,免疫荧光染色与Western blot检测上述过程中Wnt/连环蛋白β(β-catenin)信号通路变化.构建老年骨质疏松骨缺损模型,SRT1720与EX527作用的同时,分别给予Wnt信号通路抑制剂XAV939与激活剂CHIR-99021,Micro-CT、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)/Masson染色与免疫荧光染色检测各组骨缺损区域新骨形成与H型血管含量差异.结果:小鼠骨组织中SIRT1表达呈现增龄性下调趋势.SIRT1能够促进成骨因子碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、矮小相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)和促H型血管形成因子slit同源物3(slit homolog 3,SLIT3)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达,并促进老年骨质疏松骨缺损区域内H型血管形成与骨再生,且上述作用由Wnt/β-catenin信号通路介导.结论:SIRT1能够通过调控Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs成骨分化与H型血管生成,进而促进老年骨质疏松小鼠的骨缺损愈合.

目的 制备不同浓度的兔软骨脱落细胞支架,并评估其理化性能和干细胞的相容性,为软骨修复提供实验依据.方法 Percoll密度分离法培养骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),并进行流式细胞学鉴定和成骨、成软骨分化能力检测.从兔膝、股关节中切取软骨片,进行物理粉碎、反复冻融以及各种酶混合消化脱细胞.为比较并观察不同浓度脱细胞支架的理化性能差异,设计3组支架,浓度分别为100％(A组)、50％(B组)、30％(C组),每组3只.将第3代PKH26示踪的BMSCs接种于最适浓度支架上培养1周,观察细胞生长情况.结果 流式技术检测BMSCs表面抗原,CD44、CD90呈阳性表达,CD45阴性表达;成骨诱导茜素红染色可见红色钙结节;软骨诱导阿利新蓝染色见软骨结节呈蓝色;3组支架经苏木素-伊红(HE)、甲苯胺蓝染色后未观察到明显细胞形态.样本脱细胞后的DNA浓度与未脱支架的指标均值差异具有显著性(P＜0.05).糖胺聚糖含量较正常值稍偏低.3组支架两两比较孔径、吸水膨胀率、孔隙率、支架断裂强度、杨氏模量差异具有显著性(P＜0.05);干细胞与支架共培养后细胞附着良好.结论 Percoll密度分离法可获取高纯度的兔BMSCs;应用混合脱细胞方法脱细胞较彻底.B组支架可作为构建组织工程软骨修复的最适方案.体外培养的BMSCs在B组支架生长良好.

目的 研究表明微核糖核酸(microRNA,MiRNA)和Kruppel样因子10(Kruppel-like factor10,KLF10)调控骨质疏松症的进程.研究旨在探讨miR-26b/KLF10信号调控骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)分化的机制.方法 流失鉴定分离的大鼠BMSCs,不同剂量的补肾活血方处理BMSCs,检测其[1-2]增殖能力,碱性磷酸酶活性和茜素红染色检测BMSCs的成骨分化潜能.qPCR检测不同剂量的补肾活血方处理BMSCs后,miR-26b 和 KLF10 的表达水平.mirtarBase 数据库检测 KLF10 mRNA 的 3'非翻译区(untranslated regions,3'UTR)上是否有miR-26b的结合位点,双荧光素酶报告实验检测miR-26b对KLF10启动子活性的影响.qPCR检测miR-26b/KLF10信号对BMSCs增殖和成骨分化标志物的表达的影响.Western blot检查Wnt/β-catenin信号是否被激活.结果 流式分析显示分离的原代细胞大部分是BMSCs.补肾活血方显著促进骨髓间充质干细胞的增殖,补肾活血方显著提高了 BMSCs中碱性磷酸酶的水平和成骨分化的潜能.补肾活血方促进BMSCs中miR-26b和KLF10的表达.在KLF10 mRNA的3'UTR上有miR-26b的结合位点.在BMSCs中,miR-26b抑制KLF10的3'UTR荧光素酶活性.此外,miR-26b 也抑制了 KLF10 的表达水平.CCK8(Cell Counting Kit-8)显示 KLF10 促进 BMSCs 增殖,qPCR 显示 miR-26b显著抑制成骨分化标志物的表达.而KLF10能够逆转miR-26b的抑制效应,提示miR-26b/KLF10信号介导了补肾活血方在BMSCs增殖和成骨分化中的效应,且补肾活血方通过激活Wnt/β-Catenin信号通路促进成骨.结论 补肾活血方促进BMSCs的成骨由miR-26b/KLF10/Wnt/β-Catenin信号轴调控.

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是具有自我更新及多向分化潜能的成体干细胞,在维持骨组织稳态、促进骨损伤修复中发挥重要作用.衰老是机体随着生命周期延长发生的结构和功能上的不可逆变化,干细胞衰老是其重要原因之一.BMSCs的衰老不仅会导致骨稳态失衡以及骨质疏松等疾病,还会使BMSCs的临床应用受到限制.线粒体是细胞内进行能量代谢的重要细胞器,近年来研究表明线粒体功能障碍在衰老的发生和发展过程中发挥重要作用.本文对线粒体调控BMSCs衰老的作用机制进行系统综述,以期为防治BMSCs衰老、诊治衰老和代谢性骨疾病提供新的思路.

目的 探究抑制过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)表达对BMSCs成骨分化的影响,为原发性骨质疏松症(primary psteoporosis,POP)的治疗提供理论基础.方法 将骨密度正常患者提取的BMSCs分为正常对照组(CON组),POP患者提取的BMSCs分为原发性骨质疏松组(POP组),取POP组细胞加入PPARγ抑制剂,分为抑制剂组(INR组),经成骨诱导分化后,检测各组细胞中骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、Osterix、Runt相关转录因子 2(runt-related transcription factor 2,Runx2)的表达情况;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色观察各组BMSCs成骨分化情况.结果 POP组ALP阳性细胞数低于CON组和INR组(P<0.05);与CON组相比,POP组中OCN、OPN、Osterix、Runx2 表达量降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与POP组相比,INR组中OCN、OPN、Osterix、Runx2 表达量升高,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 抑制PPARγ表达后,BMSCs成骨分化特异性基因(ALP、OCN、OPN、Osterix、Runx2)表达增加.

目的 探讨帕罗西汀对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCS)成骨分化的影响及机制.方法 从大鼠后肢分离培养原代BMSCS,流式鉴定BMSCS表面标志物.细胞计数试剂盒(CCK-8)法测定不同浓度的帕罗西汀对BMSCS的细胞毒性,采用1.25、2.50、5.00 μmol/L的浓度处理BMSCS.细胞分为GM组(生长培养基培养)、OS组(成骨诱导培养基培养)、LP组(1.25 μmol/L帕罗西汀+成骨诱导培养基培养)、MP组(2.50 μmol/L帕罗西汀+成骨诱导培养基培养)、HP组(5.00 μmol/L帕罗西汀+成骨诱导培养基培养).1周后进行碱性磷酸酶(ALP)染色,3周后茜素红染色检测成骨分化水平.3周后提取细胞全蛋白,通过蛋白质印迹法(Western blot)检测成骨标志物OPN、Runx2的表达水平及核因子-κB(NF-κB)、磷酸化核因子-κB(p-NF-κB)的表达水平.添加NF-κB抑制剂PDTC后再次分组为OS、OS+PDTC、LP+PDTC、MP+PDTC、HP+PDTC组,同样分别进行ALP染色、茜素红染色及Western blot检测成骨分化水平和NF-κB表达水平.两样本间对比采取t检验,多组间差异采用单因素方差分析.结果 流式细胞检测CD73、CD90、CD29、CD44表达阳性,CD34、CD45表达阴性.OS组BMSCS的ALP染色和茜素红染色颜色较深,LP、MP、HP组染色较浅.GM 组 p-NF-κB 表达量低于 OS、LP、MP、HP 组(0.458±0.012 比 0.567±0.008、0.749±0.022、0.802±0.011、0.972±0.014,t=13.137、13.443、29.318、43.010,P＜0.05);NF-κB 表达量 OS 组与GM、LP、MP、HP 组差异无统计学意义(1.006±0.025 比 1.007±0.013、0.945±0.074、0.909±0.101、0.982±0.019,t=0.024、1.363、1.627、1.335,P＞0.05);Runx2 表达量 OS 组高于 GM、LP、MP、HP 组(0.955±0.011 比 0.585±0.014、0.746±0.012、0.584±0.016、0.489±0.013,t=36.083,21.910、33.210、67.948,P＜0.05);OPN 表达量 OS 组高于 GM、LP、MP、HP 组(0.918±0.015 比0.669±0.037、0.666±0.028、0.538±0.043、0.421±0.028,t=10.834,13.859、14.370、27.067,P＜0.05).OS、OS+PDTC、LP+PDTC、MP+PDTC、HP+PDTC 组 ALP 染色和茜素红染色程度基本相同.p-NF-κB 表达量 OS 组高于 OS+PDTC、LP+PDTC、MP+PDTC 组 HP+PDTC 组(0.790±0.044比 0.450±0.032、0.439±0.015、0.481±0.020、0.449±0.024,t=10.821,12.956、11.024、11.705,P＜0.05);NF-κB 表达量 OS 组与 OS+PDTC、LP+PDTC、MP+PDTC、HP+PDTC 组差异无统计学意义(0.866±0.019 比 0.843±0.038、0.818±0.028、0.845±0.045、0.859±0.068,t=0.930、2.404、0.722、0.178,P＞0.05);OPN 表达量 OS 组与 OS+PDTC、LP+PDTC、MP+PDTC、HP+PDTC 组差异无统计学意义(0.902±0.032 比 0.925±0.041、0.890±0.052、0.963±0.042、1.003±0.093,t=0.785、0.311、2.004、1.789,P＞0.05);Runx2 表达量 OS 组与 OS+PDTC、LP+PDTC、MP+PDTC、HP+PDTC 组差异无统计学意义(0.967±0.052 比 0.898±0.095、0.951±0.015、0.950±0.055、0.921±0.055,t=1.113、0.532、0.392、1.068,P＞0.05).结论 帕罗西汀可以通过激活大鼠BMSCS的NF-κB抑制大鼠BMSCS的成骨分化.

引经理论是中医理论的重要组成部分,牛膝可引导方中的其他药物下达病所.骨髓间充质干细胞(BMSCs)具自我更新、复制、修复及多向分化的能力.本文以中医引经理论为基础,以现代研究为主线,溯根寻源,固本逐新.通过梳理牛膝的药理作用与骨髓间充质干细胞及相关联的信号通路之间的关系,通过分析牛膝引经功效对相关信号通路上下游相关蛋白、相关转录因子等表达的关联性,进而对BMSCs的增殖、分化和迁移产生的影响,探讨牛膝引经作用促进骨髓间充质干细胞迁移的机制,在理论上填补了以往单纯对引经理论及BMSCs迁移的单独研究的空白,并对引经理论与信号通路及干细胞迁移三者之间的联系做出总结,为后续临床用药奠定理论基础.

目的 研究枸杞糖肽(LbGP)对放射后人牙龈成纤维细胞(HGFs)来源的外泌体对成骨抑制的保护作用.方法 将HGFs分为对照组、放射组及枸杞糖肽组,通过RT-qPCR、Western blotting及β-半乳糖苷酶染色检测细胞的凋亡、衰老水平以及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的差异表达.提取各组细胞分泌的外泌体,通过电镜观察、粒径分析以及Western blotting鉴定外泌体,并分别将各组牙龈成纤维细胞产生的外泌体作用于破骨前体细胞及骨髓间充质干细胞(BMSCs)中,通过Trap染色、茜素红染色、ALP染色、RT-qPCR以及Western blotting检测细胞的破骨及成骨情况.结果 衰老细胞在放射组较对照组增多,而在枸杞糖肽组较放射组减少;与对照组相比,放射组Bcl-2/Bax降低(P<0.0001),α-SMA表达水平增加(P<0.05);与放射组相比,枸杞糖肽组Bcl-2/Bax增多(P<0.05),α-SMA表达水平降低(P<0.01);与对照组相比,放射组破骨细胞增多,枸杞糖肽组破骨细胞减少;钙结节、碱性磷酸酶表达水平在放射组低于对照组,在枸杞糖肽组高于放射组;成骨相关基因(BMP2、ALP、RUNX2)及成骨相关蛋白(ALP、RUNX2)的表达水平在枸杞糖肽组高于放射组(P均<0.01).结论 枸杞糖肽可通过作用于放射后的牙龈成纤维细胞的外泌体,有效抑制破骨、促进成骨和预防放射性颌骨骨髓炎的发展,这可能为放射性颌骨骨髓炎的治疗提供一种新策略.

Background::Osteopenia has been well documented in adolescent idiopathic scoliosis (AIS). Bone marrow stem cells (BMSCs) are a crucial regulator of bone homeostasis. Our previous study revealed a decreased osteogenic ability of BMSCs in AIS-related osteopenia, but the underlying mechanism of this phenomenon remains unclear.Methods::A total of 22 AIS patients and 18 age-matched controls were recruited for this study. Anthropometry and bone mass were measured in all participants. Bone marrow blood was collected for BMSC isolation and culture. Osteogenic and adipogenic induction were performed to observe the differences in the differentiation of BMSCs between the AIS-related osteopenia group and the control group. Furthermore, a total RNA was extracted from isolated BMSCs to perform RNA sequencing and subsequent analysis.Results::A lower osteogenic capacity and increased adipogenic capacity of BMSCs in AIS-related osteopenia were revealed. Differences in mRNA expression levels between the AIS-related osteopenia group and the control group were identified, including differences in the expression of LRRC17, DCLK1, PCDH7, TSPAN5, NHSL2, and CPT1B. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analyses revealed several biological processes involved in the regulation of autophagy and mitophagy. The Western blotting results of autophagy markers in BMSCs suggested impaired autophagic activity in BMSCs in the AIS-related osteopenia group. Conclusion::Our study revealed that BMSCs from AIS-related osteopenia patients have lower autophagic activity, which may be related to the lower osteogenic capacity and higher adipogenic capacity of BMSCs and consequently lead to the lower bone mass in AIS patients.

目的:观察胰岛素样生长因子1(IGF 1)、骨髓间充质干细胞(BMSCs)与丝素蛋白羟基磷灰石复合材料构建的组织工程骨修复骨缺损的效果。方法:用45只新西兰大白兔制备骨缺损模型后随机分为3组，每组15只，A组骨缺损处不植入任何材料，B组骨缺损处植入单纯骨髓间充质与丝素蛋白羟基磷灰石复合材料复合体，C组骨缺损处植入IGF 1转染的BMSCs与丝素蛋白羟基磷灰石复合材料复合体。造模后4、8、12周，分别进行X线片拍摄、苏木精-伊红染色及三点弯曲实验，组间比较采用 t检验。 结果:造模后4周，3组均可见骨痂形成；造模后12周，A组未形成完整的骨桥，B组骨痂开始塑形，骨髓腔基本再通，C组完成骨缺损修复。B、C组最大载荷逐渐增加，C组最大载荷始终高于B组( t8＝5.208， t12＝12.837， P值均<0.05)。造模后4周，A组可见纤维组织增生与少量骨小梁形成；B、C组复合支架材料部分降解，可见骨小梁形成并相互连接。造模后12周，A仍为较多的纤维组织，B组开始塑形为皮质骨，C组基本形成新的皮质骨。 结论:IGF 1转染的BMSCs与丝素蛋白羟基磷灰石复合材料构建的组织工程骨，具有比单纯BMSCs与丝素蛋白羟基磷灰石复合材料构建的组织工程骨更强大的骨诱导能力。