目的:建立一种催化发夹自组装（CHA）联合成簇间隔的短回文重复序列及其关联蛋白12a（CRISPR-Cas12a）的传感技术，用于外泌体源性微小RNA-21（miR-21）的检测并分析其性能。方法:选取2023年9—10月在陆军军医大学第一附属医院确诊为乳腺癌的患者8例为乳腺癌组；选取同期健康体检者8名为健康对照组。采用试剂盒提取血浆外泌体及其miR-21。针对miR-21序列设计DNA发夹和CRISPR RNA序列。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光分光光度计验证检测技术可行性。进一步优化发夹浓度、CHA反应时间、Cas12a蛋白浓度和Cas12a蛋白反应时间。在此基础上，检测不同浓度（0、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 nmol/L）的miR-21，收集荧光强度采用一元线性回归方法做线性分析以评价方法学的灵敏度，同时检测不同类型miRNA（miR-31、miR-26a、miR-192、miR-25-3p）及空白对照以评价方法学特异性。采用病例对照研究，用该检测技术和逆转录PCR方法检测乳腺癌组和健康对照组血浆外泌体源性miR-21的相对表达水平以评价其临床样本检测能力。结果:应用CHA联合CRISPR-Cas12a技术建立了外泌体源性miR-21的检测方法。该方法检测miR-21的浓度与荧光强度呈良好的线性关系（相关系数为0.966 7），线性检测范围为0.1~10.0 nmol/L，检测限为87.81 pmol/L。miR-21的检测荧光强度为450.27±23.96，高于miR-31、miR-26a、miR-192、miR-25-3p和空白对照组（分别为98.89±7.35、98.12±2.07、98.93±2.45、96.66±2.45、82.93±3.54），差异均有统计学意义（ P均<0.001）。逆转录PCR结果显示，乳腺癌组血浆外泌体源性miR-21相对表达水平高于健康对照组（1.83±0.27比0.93±0.12， P<0.001）；CHA联合 CRISPR-Cas12a检测技术结果显示，乳腺癌组血浆外泌体源性miR-21相对表达水平高于健康对照组（1.94±0.21比0.98±0.08， P<0.001）；CHA联合 CRISPR-Cas12a检测技术与逆转录PCR检测的乳腺癌组和健康对照组的血浆外泌体源性miR-21相对表达水平比较，差异无统计学意义（ P均>0.05）。 结论:建立了CHA联合CRISPR-Cas12a检测外泌体源性miR-21的高灵敏度与高特异性的传感技术，其检测血浆外泌体源性miR-21的结果与逆转录PCR结果一致，可用于乳腺癌患者筛查。

目的 构建一种自催化发夹组装无酶信号放大的靶标快速荧光法,用于检测靶标miRNA.方法 首先在金纳米颗粒(AuNP)表面修饰5-羧基荧光素(FAM)标记的DNA发夹探针H1,形成探针AuNP-H1,H1的荧光被AuNP猝灭.加入靶标miRNA会导致AuNP上的H1标记荧光素远离AuNP而重新发射荧光,随后H1与DNA发夹探针H2发生循环自组装,靶标循环被利用,导致荧光信号放大.将探针AuNP-H1、探针H2及不同浓度的miRNA-721共反应后,在480 nm激发波长下测定体系的荧光强度.结果 以急性心肌炎生物标志物miRNA-721为模型靶标,在优化的实验条件下使用20 μL探针AuNP-H1、50 μL 3 μmol/L探针H2(退火缓冲液为20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2,pH 7.4)与 50 μL不同浓度(0.1～5 μmol/L)的 miRNA-721 在 30 ℃共反应20 min,发现在520 nm处的相对荧光强度变化值(△F=F-F0)与miRNA-721浓度(C)呈良好的线性关系,拟合线性方程为△F=29 232×lgC-52 435(R2=0.991 0).该荧光法检测限为1.23 nmol/L.在正常人血清中的加标回收率为92.71％～104.02％.一次完整的miRNA分析可以在20 min内完成.结论 该方法可用于生物样品中miRNA-721的检测,为急性心肌炎的早期诊断提供了一种快速检测手段.

目的 建立一种基于催化发夹自组装技术(catalytic hairpin assembly,CHA)的新型冠状病毒(简称新冠病毒)靶RNA荧光检测法,实现对新冠病毒核酸的快速检测.方法 根据CHA反应原理,选择新冠病毒核衣壳蛋白基因(N基因,NC_045512.2)上长24 nt的片段作为检测靶点(即靶RNA),设计合成发夹探针H1、H2,并在探针H1上修饰荧光基团和猝灭基团;在室温(25℃)下,向探针溶液中加入靶RNA引发CHA反应,通过检测反应过程中荧光强度的变化实现对靶RNA的快速检测;优化检测探针及反应条件,对方法的灵敏度和特异性进行评价.结果 成功建立了针对新冠病毒靶RNA的荧光CHA法,可于室温下在30 min内完成检测,该法除具有优良的特异性、可准确区分靶RNA和发生单碱基突变的靶RNA之外,还具有良好的灵敏度,检出限为50 pmol/L.结论 本研究所提出的方法实现了对新冠病毒靶RNA简单快速的检测,具有优良的特异性和灵敏度,有望通过进一步优化以用于临床新冠病毒核酸样本的快速检测.

目的:基于链置换扩增 (strand displacement amplification, SDA) 和催化发夹组装 (catalytic hairpin assembly, CHA) 级联放大策略构建电化学生物传感器用于micro RNA (miRNA) 高灵敏检测.方法:靶标miR-21引发SDA获得大量与靶标miR-21相关的触发DNA, 继而引发CHA, 得到大量生物素标记的双链DNA.然后, 所获得的双链DNA与修饰在电极表面的辅助探针杂交, 再利用生物素与链霉亲和素的特异性识别作用, 将含链霉亲和素的碱性磷酸酶 (streptavidin-alkaline phosphatase, STAP) 修饰在电极表面上, 在底物α-萘酚磷酸酯 (α-naphthyl phosphate, α-NPP) 存在下, ST-AP催化α-NPP水解, 在电极表面原位产生具有电化学活性的α-萘酚 (α-naphthol, α-NP), 获得电化学信号, 从而实现对靶标miR-21的高灵敏检测.结果:在最优实验条件下, 所制备的miR-21生物传感器的线性范围为0.1 pmol/L至10 nmol/L, 最低检测限为60 fmol/L.结论:所设计的miR-21生物传感器展现出高的灵敏度和强的特异性, 将为临床上miR-21的检测提供新思路和新平台.

目的 构建基于磁性分离和催化发夹组装(CHA)信号放大策略的外泌体双膜蛋白共表达检测平台.方法 细胞培养与细胞上清液中外泌体的分离纯化和表征.超分辨成像技术与免疫印迹实验表征CD63在外泌体膜上的表达.外泌体与AptEpCAM-T催发链反应电泳图验证EpCAM适配体与外泌体结合.荧光检测法验证CHA核酸序列的可行性、优化反应条件以及验证该方法特异性.结果 超分辨成像技术与免疫印迹实验显示乳腺癌MDA-MB-231细胞来源外泌体富含CD63膜蛋白.外泌体与AptEpCAM-T催发链反应电泳结果显示EpCAM适配体能够识别并结合外泌体.检测平台特异性试验:人正常乳腺上皮细胞外泌体(MCF-10a exo)荧光检测信噪比:1.10±0.01,乳腺癌细胞外泌体(MDA-MB-231 exo)荧光检测信噪比:2.09±0.08.结论 构建基于磁性分离和CHA信号放大策略的外泌体双膜蛋白共表达检测平台.可同时检测外泌体膜上表达的两种蛋白:CD63和EpCAM.乳腺癌细胞外泌体与人正常乳腺上皮细胞外泌体膜蛋白CD63和蛋白EpCAM表达有区分度.

微RNA(microRNA,miRNA)是一类小分子RNA,参与了众多的细胞过程,在生命体的生长发育过程中起到了关键作用.鉴于miRNA的重要性和结构特殊性,其对于疾病的预测与评估有着深刻的意义.当前,miRNA检测技术迅猛发展,其中,催化发夹自组装(catalytic hairpin assembly,CHA)是一项新型核酸恒温扩增技术,具有反应过程无需酶催化、检测灵敏度高特异性强、操作简单方便等优点,在miRNA的检测领域有着巨大潜力.本文将着重阐述CHA技术的检测原理,从靶标识别、信号扩增、信号输出3个方面对基于CHA技术的miRNA检测策略进行介绍,并提出该技术当前面临的挑战及前景,旨在为医学、生物信息等相关领域的研究提供进一步参考.