目的 构建一种自催化发夹组装无酶信号放大的靶标快速荧光法,用于检测靶标miRNA.方法 首先在金纳米颗粒(AuNP)表面修饰5-羧基荧光素(FAM)标记的DNA发夹探针H1,形成探针AuNP-H1,H1的荧光被AuNP猝灭.加入靶标miRNA会导致AuNP上的H1标记荧光素远离AuNP而重新发射荧光,随后H1与DNA发夹探针H2发生循环自组装,靶标循环被利用,导致荧光信号放大.将探针AuNP-H1、探针H2及不同浓度的miRNA-721共反应后,在480 nm激发波长下测定体系的荧光强度.结果 以急性心肌炎生物标志物miRNA-721为模型靶标,在优化的实验条件下使用20 μL探针AuNP-H1、50 μL 3 μmol/L探针H2(退火缓冲液为20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2,pH 7.4)与 50 μL不同浓度(0.1～5 μmol/L)的 miRNA-721 在 30 ℃共反应20 min,发现在520 nm处的相对荧光强度变化值(△F=F-F0)与miRNA-721浓度(C)呈良好的线性关系,拟合线性方程为△F=29 232×lgC-52 435(R2=0.991 0).该荧光法检测限为1.23 nmol/L.在正常人血清中的加标回收率为92.71％～104.02％.一次完整的miRNA分析可以在20 min内完成.结论 该方法可用于生物样品中miRNA-721的检测,为急性心肌炎的早期诊断提供了一种快速检测手段.

目的 探讨我国弓形虫Chinese 1优势基因型感染对宿主脑组织铁代谢及脑损伤的影响.方法 将20只C57BL/6(体质量15～17 g)小鼠随机分为对照组和感染组,每组10只.感染组每只小鼠腹腔注射4 000个弓形虫Chinese 1优势基因型TgCtwh3虫株速殖子,对照组小鼠注射等量无菌PBS,饲养6 d后处死小鼠并取其脑组织.采用电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)检测小鼠脑组织铁元素水平;采用RNA芯片检测两组小鼠脑组织差异基因数目并对功能基因表达情况进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能富集;采用实时荧光定量PCR(fluorescent quantitative real-time PCR,qPCR)技术检测小鼠脑组织中弓形虫表面抗原 1(Toxoplasma gondii surface antigen 1,TgSA4G1)基因及部分锌铁调控蛋白(Zrt-and Irt-like protein,ZIP)家族mRNA表达水平;采用光镜和电镜观察小鼠脑组织海马齿轮回(dentate gyrus,DG)超微结构;采用Western blotting检测谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPx4)蛋白表达水平;采用硫代巴比妥酸(TBA)法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平;采用免疫组化检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达光密度(optical density,OD)值.结果 光镜下可见感染组小鼠脑组织海马DG区细胞坏死,电镜下见感染组小鼠脑组织海马区出现胞质空泡化、核皱缩坏死、线粒体嵴断裂消融、自噬小体增加等超微结构变化.与对照组相比,感染组小鼠脑组织中铁元素水平上调[(32.92±0.90)μg/g vs.(37.72±1.10)μg/g;t=3.397,P＜0.01];RNA芯片检测感染组小鼠脑组织发现721个基因上调、276个基因下调,差异表达基因在金属离子结合能力上有明显富集.与对照组相比,感染组小鼠脑组织金属元素转运体ZIP2 mRNA表达水平上调(t=8.659,P＜0.05)、GPx4表达下降[(1.046±0.025)vs.(0.720±0.101);t=3.129,P＜0.01])、MDA水平升高[(4.37±0.33)nmol/mngprot vs.(5.93±0.54)nmol/mgprot;t=2.451,P＜0.05)]、VEGF蛋白平均OD值上调[(0.348 3±0.017 8)vs.(0.490 6±0.010 5);t=6.641,P＜0.01].结论 Chinese 1优势基因型弓形虫感染后,小鼠脑组织中铁元素蓄积、抗氧化能力下调、氧化应激水平升高,提示弓形虫感染可影响宿主脑组织铁代谢而导致脑损伤.

目的 CatSper1是精子特定的电压门控Ca2+通道蛋白,在精子生成和受精过程中具有重要作用.本研究旨在分析CatSper1基因在版纳微型猪近交系(BMI)的表达调控模式、序列特征与潜在的生物学功能.方法 取成年BMI公猪睾丸进行转录组测序;采用RT-PCR技术克隆CatSper1的完整编码序列;分析CatSper1的序列、结构特征及相互作用蛋白;利用转录组测序数据构建CatSper1的lncRNA和miRNA调控网络,并进行GO功能注释.结果 RNA-seq获得CatSper1基因的平均表达量和平均TPM值分别为2817.5和33.6.CatSper1 CDS区全长为2166 bp(GenBank登录号:OK042306),编码721个氨基酸,含有233个氨基酸残基组成的Ion_trans保守结构域以及与精子生成相关的保守跨膜螺旋结构.CatSper1蛋白与10个雄性育性相关蛋白质存在相互作用,尤其与该基因家族成员CatSper2-4蛋白互作最为紧密.CatSper 1基因受10个miRNAs靶向调控,分别有16个和14个lncRNAs与CatSper1竞争性结合ssc-miR-1343和ssc-miR-744.GO注释发现CatSper1基因在分子功能(MF)、生物学过程(BP)、细胞成分(CC)等方面均具有重要功能.结论 本研究报道了CatSper1在BMI睾丸中的表达,基因的分子结构特征和表达调控网络,为深入研究CatSper1基因在BMI精子发生、精子获能和顶体反应等重要生物学过程中的功能奠定了基础.