为探究蓝藻低磷适应机制,研究鉴定了海洋聚球藻PCC 7002中可能的磷调控基因phoR(A2100),并通过生物信息学的方法对PhoR蛋白理化性质进行了分析,发现phoR基因长度为1296 bp,编码431个氨基酸,PhoR蛋白由PAS、HisKA和HATPase c三部分结构域组成,在不同蓝藻物种中序列较为保守.随后通过原核表达获得了PhoR重组蛋白,并制备其鼠源多克隆抗体,检测了PhoR在聚球藻PCC 7002中缺磷诱导时的表达变化,证明PhoR蛋白在磷缺乏时大量诱导表达.为探究PhoR在聚球藻PCC 7002中的生理功能,通过缺失突变获得了Mut-pho突变株,并分析了其生理表型,发现Mut-phoR突变株在磷限制条件下出现显著的生长缺陷及光合作用的损伤,证明PhoR是聚球藻PCC 7002适应低磷环境不可缺少的.研究结果为深入认识蓝藻的低磷适应分子机制提供了科学基础.

微藻是地球上光合微生物的原始种类之一,由于其生长周期较短、生长速率较快和生产高附加值产物的潜力而被广泛开发利用.然而,在微藻放大生产的过程中极易受到高盐等非生物胁迫的不利影响,极大地限制了微藻的生产力.因此,了解微藻盐胁迫响应的分子机制将有助于耐盐藻株的快速建立.本文总结了真核微藻和原核蓝藻响应盐胁迫的各种参与蛋白及其具体作用机制,包括转运蛋白维持离子稳态、积累渗透调节物质、抗氧化防御机制、信号蛋白和脂质积累等;同时综述了已被开发利用的天然耐盐藻包括杜氏盐藻(Dunaliella salina)、盐生隐杆藻(Aphanothece halophytica)、皮克绿球藻(Picochlorum sp.)和海洋绿藻(Chlamydomonas W80)等微藻及其耐盐基因的研究进展;最后讨论了典型盐响应基因在优良藻种选育中的价值与应用前景.

为探究城市景观水体中固氮微生物群落结构、多样性及固氮活性,揭示水体中固氮蓝藻的固氮贡献,研究选取新乡市牧野湖和人民公园水体两个小型水体进行研究.通过理化指标测定,发现两个水体均处于富营养化状态,借助高通量测序,对两水体中微生物的16S rDNA和固氮酶nifH基因进行测序,并利用乙炔还原法测定水体中固氮微生物的固氮速率.结果表明:牧野湖水体中的原核生物类群共检测出32个门,275个属;固氮微生物共检测出9个门,66个属.人民公园水体中的原核生物类群共检测出31个门,238个属;固氮微生物共检测出4个门,13个属.固氮蓝藻在两个水体固氮微生物类群中分别占有3％和9.3％,牧野湖固氮微生物丰富度相对较高,与人民公园水体固氮微生物多样性差异较大.乙炔还原法测固氮速率结果显示,两水体均未检测到固氮活性,推测在富营养化的水体中固氮活性可能被抑制.

[背景]蓝藻中生成琥珀酸的三羧酸循环途径与其他物种不同.由于α-酮戊二酸脱羧酶和琥珀酸半醛脱氢酶的存在使得蓝藻的三羧酸循环途径变得完整.琥珀酸半醛脱氢酶催化琥珀酸半醛氧化为琥珀酸,在蓝藻中广泛存在.[目的]克隆、表达和纯化蓝杆藻ATCC51142中cce4228基因编码蛋白,并对其进行生化表征.[方法]以蓝杆藻ATCC51142基因组为模板克隆得到cce4228基因,将其插入到原核表达载体pET-28a上,在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中进行异源表达,利用Ni-NTA树脂纯化cce4228蛋白.运用紫外分光光度法和生物信息学方法表征重组cce4228蛋白生化特性.[结果]构建了pET-28a-cce4228重组表达质粒,重组cce4228蛋白在大肠杆菌中得到可溶性表达,获得了纯度大于90％的cce4228蛋白.酶动力学测试和生物信息学分析结果显示,cce4228蛋白是一个NADP+-依赖型的琥珀酸半醛脱氢酶.[结论]蓝杆藻ATCC51142中cce4228基因编码一个偏好NADP+辅因子的琥珀酸半醛脱氢酶,cce4228蛋白的生化表征结果为进一步深入研究cce4228蛋白的结构功能关系及催化机制奠定了基础.

天然抗氧化剂对于清除人体内自由基、保障健康具有重要作用.藻蓝蛋白(phycocyanin,PC)是蓝藻等藻类细胞内的一类特殊色素蛋白,具捕获光能的功能.体外研究发现,藻蓝蛋白具有较显著的抗氧化、抑癌细胞增殖等生物活性.试验利用食源性的拟球状念珠藻葛仙米(Nostoc sphaeroides)的基因组DNA为材料,借助PCR扩增克隆葛仙米藻蓝蛋白两个重要亚基α与β基因,Ns-PC-α和Ns-PC-β.结果 表明,葛仙米基因组中,Ns-PC-α和Ns-PC-β基因编码框长度分别为492 bp和522 bp;Ns-PC-α和Ns-PC-β基因以双顺反子形式存在,Ns-PC-α位于Ns-PC-β下游.Ns-PC-α和Ns-PC-β分别编码由163与173个氨基酸组成的蛋白.Ns-PC-oα和Ns-PC-β亚基蛋白多肽链中共含有3个半胱氨酸残基(Ns-PC-α的第85位与Ns-PC-β中的第83位氨基酸残基和第154位氨基酸残基),很可能是藻蓝胆素的结合位点.原核表达显示Ns-PC-α和Ns-PC-β分子量为近18kD,Ns-PC-α比Ns-PC-β略小,与预测结果一致.模拟其高级结构,发现Ns-PC-α和Ns-PC-β单亚基均含有7个α-螺旋,除N端α-螺旋外,其它几个α-螺旋进一步折叠形成疏水核心区;并且,Ns-PC-α和Ns-PC-β结构上能够较好吻合,形成一稳定而封闭的单体,弧度近2π/3.Ns-PC-α和Ns-PC-β组成的这种单体结构是其进一步建构圆盘状三聚体Ns-PC-(α/β)3的重要基础.本研究结果为食源性念珠藻葛仙米藻蓝蛋白抗氧化功能的进一步应用提供了重要依据.

蓝藻是地球上最古老的生物之一,其形态结构较为简单,为产氧型光合作用的原核生物.山西省晋阳湖为华北地区最大的人工湖,该研究以采自晋阳湖水体及岸边附着的蓝藻为材料,采用经典毛细管法分离纯化出5株丝状蓝藻,利用光学显微镜观察其形态结构特征(如细胞形状、藻丝体宽度、是否有鞘)和显微结构,并采用16S rRNA序列分析其系统发育关系,以明确晋阳湖的蓝藻种类,为预防湖泊蓝藻水华的发生、维护水资源环境稳定与生态平衡提供理论数据.结果显示:(1)所分离纯化的5株丝状蓝藻依形态特征归属于3个科,其中2株(JYH005和 JYH012)为细鞘丝藻亚科(Leptolyngbyaceae),2株(JYH008和 JYH022)为伪鱼腥藻科(Pseudanabaenaceae),1株(JYH010)为沙丝藻科(Desertifilaceae).(2)基于16S rRNA序列构建的系统发育树显示,5株丝状蓝藻中JYH005为结丝藻属(Nodosilinea)的一种;JYH008可归为Arthronema,该株蓝藻在培养条件下观察到不同的形态特征,可能为新物种;JYH010为沙丝藻属(Desertifilum)的一种;JYH012可归为细鞘丝藻属(Leptolyngbya);JYH022与伪鱼腥藻科聚为一支,由于与该科其他藻相似度低于90％,且不能聚为一支,因此只能归为伪鱼腥藻科.研究表明,基于16S rRNA序列系统发育分析与形态学鉴定结果相一致.该研究结果丰富了山西省晋阳湖丝状蓝藻的多样性,为该湖的资源利用和环境保护提供了一定的科学依据.

为了揭示台风前后海水池塘贝类养殖过程中浮游生物群落结构的变化,对养殖水体环境基因组DNA中16S 和18S rRNA基因进行了高通量测序和生物信息学分析.结果显示,原核生物OTU数(28728)明显高于真核生物(8498),其中原核生物优势类群主要为变形菌门(Proteobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和绿菌门(Chlorobi)等;真核生物优势类群为纤毛虫、鞭毛虫、原绵虫、杯鞭虫、隐藻、棕鞭藻和硅藻等,其中硅藻丰度占比在台风后显著性增加(P＜0.05).台风过后真核生物多样性均未发生显著改变,原核生物Shannon指数和Simpson指数出现显著性差异(P＜0.05),表现为先降低后升高,而OTU数和Chao I指数则未发生显著改变.PCoA分析显示,台风后原核和真核生物群落结构均产生时间异质性,但仅原核生物群落结构产生显著差异.ANOSIM显示,真核和原核微生物群落在台风前后均存在显著性差异(P＜0.05),其中原核微生物每个时间点之间均有显著差异(P＜0.05),而真核微生物仅在10d后出现显著差异(P＜0.05).RDA分析显示,水温对原核群落结构有显著影响(P＜0.05),而化学需氧量和活性磷酸盐则对真核生物群落结构有显著影响(P＜0.05).研究表明,在台风扰动后,海水池塘浮游生物群落在短期内均发生了显著改变,原核生物群落改变大于真核生物,细菌群落多样性水平在先显著降低,后恢复至台风前水平,表现出相较于真核微生物更强的敏感性,且两者均未能恢复至台风前群落组成.因此,在海水池塘贝类养殖中应对台风影响的重点措施应主要放在防止养殖生物对环境剧变产生应激,并适当补充用于环境调节的益生菌制剂,以弥补台风造成的菌相改变可能带来的生态功能缺失.

目的·制备高纯度的蓝藻丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor,serpin),筛选其靶蛋白酶,并探究其抑制活性.方法·通过氨基酸序列分析,在人类口腔微生物组数据库(eHOMD)发现了一种钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)的serpin,将其命名为arthropin;构建融合表达载体pSUMO3-arthropin,将其转入大肠埃希菌BL21(DE3)诱导表达;采用镍离子亲和层析、酶切、反向镍离子亲和层析、阴离子交换层析的4步层析纯化方案将arthropin重组蛋白分离纯化;将arthropin重组蛋白分别与活化的凝血因子Ⅸ(activated factor Ⅸ,FⅨa)、FⅩa、FⅪa、活化的蛋白C(activated protein C,APC)、激肽释放酶1(kallikrein 1,KLK1)等14种丝氨酸蛋白酶共孵育,再利用SDS-PAGE分析共价复合物形成情况,利用反应动力学方法检测arthropin对KLK1的抑制速率.对arthropin重组蛋白的结晶条件进行筛选,选取合适的晶体进行X射线衍射并采集数据.利用AlphaFlod Colab预测arthropin亚稳态结构模型.结果·SDS-PAGE分析发现,arthropin融合蛋白在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达;纯化后,获得了高纯度的与理论相对分子质量(45800)相近的arthropin重组蛋白.将arthropin重组蛋白与14种丝氨酸蛋白酶共孵育后发现,arthropin能与FⅩa、APC、FⅨa、FⅪa、胰蛋白酶(trypsin)、组织蛋白酶G(cathepsin G)、KLK1、KLK7和凝血酶(thrombin)9种蛋白酶形成稳定的共价复合物.Arthropin抑制KLK1的二级反应抑制速率常数为1.7×103 L/(mol·s).Arthropin重组蛋白可以在25％聚乙二醇单甲醚550(PEG MME 550)、0.1 mol/L吗啉乙磺酸(MES,pH 6.5)、0.01 mol/L ZnCl2条件下形成片状晶体,X射线衍射分辨率为10 ?(1 ?=1×10-10 m).AlphaFlod Colab预测结果发现,arthropin具有经典的抑制型serpin的结构特点.结论·成功获得高纯度的钝顶节旋藻丝氨酸蛋白酶抑制剂arthropin,其具有较广谱的丝氨酸蛋白酶抑制能力,但抑制速率较低.