目的:探索原核表达新型冠状病毒受体结合蛋白（RBD）的制备方法，并对其在小鼠体内的免疫原性进行评价。方法:用大肠埃希菌表达重组新型冠状病毒RBD，进行纯化、透析复性，比较了RBD复性前后的结构表征和抗原活性变化，最后将制备所得重组RBD免疫Babl/c小鼠，检测免疫小鼠体内的体液免疫和细胞免疫变化情况。结果:完成了大肠埃希菌表达的新型冠状病毒重组RBD的制备。复性前后，RBD的自发荧光波长发生蓝移现象，从（363.33±0.47）nm蓝移至（333.00±0.82）nm，蛋白形状从无序状态折叠为（9.55±0.39）nm的颗粒，复性后RBD与ACE-2的结合活性是复性前的128倍。活病毒中和抗体检测结果显示：血清对原型株的滴度几何平均数为136.70，对贝塔株为101.59，两者无统计学差异( t=0.41， P=0.700)。试验组小鼠脾淋巴细胞产生的分泌特异性IFN-γ的效应T细胞为(308.50±144.11)个斑点形成细胞/5×10 5个细胞，低于对照组[(3.75±3.11)个斑点形成细胞/5×10 5个细胞]，差异有统计学差异( t=4.72， P=0.010)。 结论:成功制备原核表达的新型冠状病毒重组RBD，通过体外复性折叠，能够产生良好、全面的免疫原性。

目的:制备GII.3[P12]型人源诺如病毒(human norovirus, HuNoV)广州株GZ2013-L20的病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)和多克隆抗体，系统表征其免疫原性特征和受体结合能力，为HuNoV防控提供数据支撑。方法:以GZ2013-L20毒株基因组为模板，扩增ORF2并构建重组转座载体，转化至大肠埃希菌 DH10 Bac获得重组杆状病毒质粒Bacmid-L20-ORF2，在昆虫细胞sf9中表达目的VLP，采用透射电镜、SDS-PAGE、Western blot(WB)和受体结合实验等方法对纯化后VLP进行鉴定。此外，将VLP免疫小鼠获得多克隆抗体，通过间接ELISA和受体结合阻断试验进行评价。 结果:构建了重组杆状病毒Bacmid-L20-ORF2，并成功获得目的毒株VLP；透射电镜显示颗粒直径约为30 nm；SDS-PAGE和WB结果显示蛋白相对分子质量(Mr. ×10 3)约58；受体结合实验表明，目的VLP与分泌型唾液受体(A型、B型、AB型和O型)、O型非分泌型唾液受体以及猪胃黏蛋白均能有效结合；VLP多克隆抗体效价达到2×10 5，且与20种(20/28)基因型HuNoV的衣壳蛋白具有交叉免疫反应；受体结合阻断实验显示，多克隆抗体仅对同型VLP具有中和阻断效果，而对GII.2、GII.4、GII.8和GII.17等基因型VLP没有中和作用。 结论:GII.3[P12]型HuNoV广州株VLP与分泌型和非分泌型唾液受体均呈现较强的结合能力，其多克隆抗体具有免疫结合广谱性，但中和阻断效果仅对同型病毒有效，其结果为疫苗研发的理性设计提供基础数据。

目的:尝试构建永生化的人瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFbs)系，并对其功能进行鉴定。方法:标本取自1例2019年11月在北京大学第三医院行耳垂瘢痕疙瘩手术切除的32岁女性患者。将获得的瘢痕疙瘩去除皮下脂肪和表皮，应用组织贴壁法进行分离和培养，获得原代KFbs，以胰蛋白酶消化法进行传代培养；用SV40慢病毒感染原代KFbs，经过嘌呤霉素筛选纯化、传代扩增，获得永生化的人KFb系。对原代KFbs及其细胞系进行染色体核型分析、短串联重复序列(STR)和性别基因检测，来鉴定细胞系身份；采用CCK-8法检测原代KFbs和细胞系增殖能力，并分别用实时定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法检测其特定基因(PGK1、ENO1、LDHA、GLUT1、TGF-β1、COL1、COL3、FN)的mRNA和蛋白表达水平。原代KFbs与细胞系间相关数据比较采用 t检验， P<0.05表示差异有统计学意义。 结果:原代KFbs和构建的细胞系的细胞形态均呈典型的长梭形，对细胞系连续培养传代至20代，细胞形态与原代KFbs基本相似。性别基因检测显示两者均为女性，且两者的染色体核型分型良好，仍保留正常细胞的基本特征，而未发生恶性转变。STR鉴定结果显示，细胞系中未发现多等位基因，表明其为正常细胞的基因型，且该细胞系与已知细胞数据库信息均无重合。培养后24、48、72 h细胞系的增殖能力比原代KFbs分别增加了76.1%、125.8%、60.3%，其增殖速度明显较原代KFbs增快( P<0.05)；细胞系中上述特定基因的mRNA及蛋白表达水平与原代KFbs相比无显著改变( P均>0.05)。 结论:成功建立了永生化的人KFbs系，其形态、表征和功能未发生明显改变，且其增殖速度较原代细胞增快。

该研究采用超高速离心和蔗糖密度梯度离心分离纯化石榴皮胞外囊泡(pomegranate peel-derived extracellular nanovesicles,PPENs)并对其进行形貌结构表征.体外α-葡萄糖苷酶抑制实验及胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)HepG2细胞模型测试显示,PPENs具有良好的抗糖尿病活性,α-葡萄糖苷酶抑制IC50为(35.3±1.1)μg·mL-1,显著优于阳性药品阿卡波糖(acarbose).PPENs在100μg·mL-1可以显著提高IR细胞的葡萄糖吸收量.通过色谱-质谱联用开展PPENs脂质组、蛋白质组及代谢物分析,对microRNA(miRNA)序列进行鉴定和人类靶基因预测分析.分析结果表明,PPENs含有丰富的脂质和转运蛋白,为PPENs的跨组织运输与分布提供物质基础.京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Ge-nomes,KEGG)通路富集分析提示,脂质和miRNA可能是PPENs发挥抗糖尿病活性的关键成分.

[目的]开发一种新型DNA测序酶,解决一代测序技术应对复杂DNA结构模板所面临的主要挑战,如测序信号中断或测序信号快速衰减.[方法]从NCBI数据库中挖掘到了Taq DNA聚合酶和单链结合蛋白SSB基因信息,利用遗传融合、定点突变及基因设计技术获得了一种新型的测序酶Sso-Sequenase.利用亲和层析和离子交换层析,获得了纯化的测序酶.利用抗体修饰技术改良了Sso-Sequenase的性能,并且利用STR技术对其热启动性能进行了表征.选取多组不同类型的复杂模板,采用一代技术对比分析了Sso-Sequenase测序酶试剂盒和传统BigDye测序试剂盒的测序表现.[结果]Sso-Sequenase在大肠杆菌中稳定表达,纯度达到 95%以上,产量高达 10.5 mg/L.当温度低于 35℃时,Sso-Sequenase表现出热启动活性.在复杂模板的一代测序反应中,如重复序列、高GC和发夹结构等样本,Sso-Sequenase测序酶成功完成了所有样本的测序,序列的平均碱基质量QV大于 20.相比而言,BigDye测序试剂盒在处理这些复杂样本时,多数样本测序信号出现了显著衰减或中断.[结论]开发了一种纯度好、产量高,兼具热启动活性的DNA测序酶Sso-Sequenase及测序试剂盒,显著提高了复杂DNA结构模板(重复序列、高GC和发夹结构)测序成功率.

用于白及多糖(Bletilla striata polysaccharide,BSP)提取主要有溶剂提取法、辅助提取法等;分离纯化主要有活性炭或双氧水脱色,Sevage法脱蛋白,柱色谱法分离等;含量测定中通常使用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法;分子量采用高效液相色谱法、红外光谱、凝胶渗透色谱等方法来进行测定;结构表征主要采用液相色谱,红外光谱或核磁共振法来进行测定.白及多糖为葡甘聚糖,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、免疫调节和促进伤口愈合等多种生物活性,在生物医药领域有广泛的应用前景.BSP有良好的药理活性,目前其研究大部分为粗多糖,药理活性仍在细胞阶段.因此对其提取分离纯化、结构鉴定、生物活性的研究仍是社会关注的热点.主要综述了 BSP的提取分离纯化、结构组成及生物活性的研究进展并对其进行系统分析,为BSP的深度开发利用以及后续的研究提供了理论基础.

目的 分离纯化半夏多糖,分析其结构及抗氧化、免疫增强活性.方法 使用水提-醇沉法提取半夏多糖,经阴离子交换色谱柱分离纯化,苯酚-硫酸法测定总糖含量,Lowry法测定蛋白质含量,PMP-柱前衍生HPLC法测定单糖组成及比例,并对纯化多糖进行紫外-可见光谱和红外光谱分析,并测定其对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的清除作用及对RAW264.7 细胞增殖的影响.结果 半夏多糖纯化得PTC0、PTC01、PTC02 和PTC05 共 4 个组分,单糖组成复杂、比例差异大.PTC0 对超氧阴离子自由基和DPPH自由基清除作用最强,IC50值分别为 999.8、1 011.4 μg/mL,PTC01 对羟自由基的清除作用最强,IC50 值为 1 003.3 μg/mL.PTC02 在 400 μg/mL 时促进RAW264.7 细胞的增殖效果最好,细胞活力达 161.9%.结论 半夏多糖可作为天然抗氧化剂和免疫调节剂用于药物的开发.

采用碱性蛋白酶酶解提取草菇子实体多肽,透析法对其进行分离纯化得到 3-10、1-3 及1 kDa以下3种多肽组分,比较3种组分的体外抗氧化活性.用液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)、紫外吸收光谱、傅里叶红外光谱和氨基酸的测定方法表征纯化后多肽结构.结果表明,1-3 kDa 组分的抗氧化活性最强,其 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除率达到 99.81%,铁离子自由基还原能力为 1.47,2,2'-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS+]自由基和羟自由基的清除能力分别达到99.15%、99.34%.此分子量的草菇抗氧化肽的总蛋白含量为 71.12%,灰分含量为 12.75%,水分含量为 8.44%,其他为 7.69%.经鉴定表明草菇子实体多肽是一种优质蛋白质.

胰岛素瘤相关蛋白-2(insulinoma-associated protein-2,IA-2),是属于酪氨酸磷酸酶样蛋白家族的跨膜糖蛋白,也是诊断 1 型糖尿病的重要自身抗原,相关产品已在欧美国家上市.目前,商业化的IA-2 抗原主要为重组IA-2ic结构域,或从牛胰岛中天然提取的IA-2,其中重组IA-2 抗原在临床上存在弱阳性漏检的问题,无法完全替代天然提取IA-2 抗原.本研究利用HEK293 表达系统探究IA-2 的重组生产.通过瞬时表达IA-2 的第 449?979 位氨基酸跨膜片段(IA-2 transmembrane fragment,IA-2 TMF)这一天然形式的膜蛋白,并优化表达条件和膜蛋白溶解条件,纯化后膜蛋白得率为 0.78 mg/L细胞发酵液.随后,通过酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),对比IA-2 TMF与RSR rhIA-2 的抗原活性,检测了 77 位 1 型糖尿病患者血清和 32 位健康志愿者血清,测试的结果通过接受者操作特性曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)表征敏感性和特异性.结果表明:IA-2 TMF的敏感性为71.4%(55/77),而RSR rhIA-2的敏感性为63.6%(49/77),2 种抗原特异性均为 100%.2 种抗原在特异性上无明显差异,而IA-2 TMF的敏感性略优于进口金标RSR rhIA-2 抗原.综上所述,本研究基于HEK293 重组表达的IA-2 TMF能够作为 1 型糖尿病体外诊断试剂开发的原料.

目的:从竹节参中分离纯化均一多糖,对其进行结构表征和体外免疫活性研究.方法:采用水提醇沉法制备粗多糖,经Sevag法脱蛋白得到精制的竹节参多糖(PJPS),通过乙醇分步沉淀法、DEAE-52 和Sephacryl S-400柱色谱法分离纯化得到均一多糖PPS,采用高效凝胶渗透色谱HPGPC-RID测定PPS的相对分子量,1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生HPLC法测定单糖组成,GC-MS分析甲基化产物,IR、一维和二维核磁等方法对PPS进行结构表征,并采用小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7 细胞株,观察了PJPS和PPS对细胞活力、NO释放、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)表达的影响.结果:PPS是一种葡聚糖,相对分子质量为 3.3 kDa,PPS的主链为α-D-(1→4)-连接的葡聚糖,每 5 个Glcp糖基的 6 位与α-t-Glcp连接形成侧链.PPS能促进RAW 264.7 细胞增殖,PJPS和PPS能促进细胞分泌NO、TNF-α和 IL-6.结论:PPS为从竹节参中分离得到的均一多糖,具有一定的免疫活性,对PPS结构和活性的研究可为竹节参的深入开发和利用提供参考.