双光子显微镜(two-photon microscopy,TPM)是一种基于双光子激发荧光(two-photon microscopy,TPEF)和二次谐波产生(second harmonic generation,SHG)对皮肤组织进行非侵入性光学检测的方法,无需荧光染料,具有更精准成像、穿透组织更深、对细胞和组织的光损伤和光毒性更小等优势,在皮肤科疾病辅助诊断及治疗效果监测等诸多方面具有广泛应用前景.

目的 建立双光子显微镜下可视化胶质瘤、壁细胞和血管的活体自发荧光的基因小鼠模型并进行评价.方法 以PDGFRβ-Cre+/-:Rosa26-tdTomato+/-基因工程小鼠为观察壁细胞和血管结构的载体,接种GL261-CFP小鼠胶质瘤细胞并对颅骨进行透明化,通过双光子显微镜动态跟踪观察胶质瘤增殖侵袭过程中血管与壁细胞的动态变化.结果 通过基因鉴定证实 PDGFRβ-Cre+/-:Rosa26-tdTomato+/-基因工程小鼠成功繁育.对比C57BL/6 小鼠,基因工程小鼠的形态外观和繁殖等无显著性差异,组织苏木素-伊红(HE)染色切片分析显示脏器发育无异常.Tamoxifen诱导下基因工程小鼠的Cre重组酶活性至第 7 天作用完全.接种GL261-CFP后观察到胶质瘤增殖侵袭的动态过程及肿瘤内血管形态结构紊乱、游离壁细胞增多.结论 成功构建了荧光可视化壁细胞的基因工程小鼠,分别利用异硫氰酸荧光素-葡聚糖标记血管和青色荧光标记肿瘤细胞,使用玻璃圆片与固定环替代小鼠颅骨,实现了活体状态下长期稳定地动态跟踪小鼠接种脑肿瘤后血管及血管支持细胞的形态结构变化,为研究脑胶质瘤提供了病理可视化的动物模型.

目的 建立脑无复流模型并对灌注减低进行多维度评价.方法 利用激光散斑对比成像和双光子活体成像,比较C57BL/6(n=16)和BALB/c小鼠(n=37)短暂性大脑中动脉闭塞,以及BALB/c小鼠缺血1h或1.5h灌注改变情况.结合激光散斑对比成像、低倍率和较高放大倍率的灌注脑片图像,以及双光子显微镜监测红细胞流速和流量对短暂性大脑中动脉闭塞后脑灌注下降进行活体动态以及全脑切片和微血管的评估.用微管相关蛋白2染色和行为学评分评估梗死面积和行为学缺损.结果 在C57BL/6小鼠中,大脑中动脉区域大多数毛细血管在缺血期间仍然流动,而在BALB/c小鼠中,大多数毛细血管被阻断.此外,BALB/c小鼠缺血1.5 h后,24 h后再通时的皮质灌注减少至基线76.1%(与BALB/c sham组89.0%相比减少,P = 0.046),而缺血1 h减少至79.9%,与BALB/c sham组无明显差异(P=0.299).切片全脑灌注评估BALB/c小鼠短暂性大脑中动脉闭塞1.5 h导致全脑灌注减少至75.1%(与BALB/c sham组100%相比降低,P＜0.001),双光子活体成像评估大脑中动脉流域皮质表面毛细血管血流在再通24h,红细胞流速降至基线水平的50.3%(与BALB/c sham组110.7%相比降低,P=0.010),红细胞流量降至基线水平的38.9%(与BALB/c sham组119.2%相比降低,P=0.010);高倍率切片成像评估毛细血管有灌注长度为241μm±33 μm(与BALB/c sham组997 μm±103 μm相比减少,P=0.001),有灌注的毛细血管占据的总体积分数为0.0128±0.0018(与BALB/c sham组0.0539±0.0055相比减少,P＜0.001).微管相关蛋白2染色提示BALB/c小鼠短暂性大脑中动脉闭塞1.5 h导致梗死面积占全脑面积约36%,行为学评分提示行为学缺损,评分升高至9分.结论BALB/c小鼠短暂性缺血1.5 h导致明显的脑灌注下降以及毛细血管无复流,适合建立无复流模型.激光散斑对比成像、低倍率和较高放大倍率的灌注脑片图像,以及双光子显微镜活体成像的结合,可以对灌注变化进行多维度评价.

目的 基于Unet基础架构进行改进,探索构建一种适用于对二维钙成像荧光图像进行识别分割的神经网络.方法 利用微型化双光子显微镜(mTPM)对自由移动小鼠脑区进行成像,使用NoRMCorre算法对成像数据进行运动校正,校正后使用ImageJ处理成像数据获得原始图像,并使用Labelme制作标签.搭建神经网络HDCGUnet,使用原始图像和标签进行训练,根据训练效果优化改进模型结构,并选取评价指标和其他模型进行比较,验证模型效果.结果 HDCGUnet模型在自行采集制作的双光子钙成像数据集中表现最佳,并在BBBC数据集上表现良好.结论 HDCGUnet为双光子钙成像图像的识别与分割提供了一种新的选择.

次氯酸(hypochlorous acid,HClO)由于其高氧化性和反应活性,与神经退行性疾病、炎症、癌症等多种病理生理过程相关.在细胞水平上检测HClO对了解各种疾病的发病机制具有重要意义.因此,科学家设计并合成了多系列的小分子荧光探针用于细胞内HClO成像.本文综述了基于识别机制的双光子荧光探针的代表性案例,为相关工作者提供设计策略参考.

基于双光子激发荧光和二次谐波原理的双光子荧光显微镜(Two-pho-ton fluorescence microscopy,TPM)是近年来生物成像领域最重要的发明之一.这项技术具有许多独特的优点,如激光穿透深度增强、光漂白毒性小和组织光损伤减少等.由于其优异的穿透能力和光学切片能力,TPM是目前在完整组织或活体动物体内以亚细胞分辨率对细胞和器官结构和功能活性进行实时、无创、在体监测强有力的工具,已被广泛应用于生物学和医学等各种领域.在过去的几年里,TPM作为临床研究和皮肤疾病实时检测、诊断和治疗监测的新方法,取得了较多的进展.将这些技术应用到临床研究和实践中需要临床医生了解它们的基本原理、优点和局限性等,本文简要的综述了双光子荧光激发原理、二次谐波原理以及TPM在皮肤病学领域中的应用.

神经科学研究的发展在很大程度上取决于神经科学研究技术,特别是神经光子学的进展.双光子显微镜不仅仅用于简单的大脑皮层活体形态和钙成像,还可用于实时动态和长时间的形态结构和功能的观察,特别是结合膜片钳和光遗传技术对脑皮层微环路(各种神经元和胶质细胞之间作用)起着决定性的作用,同时也是很好的单细胞测序技术手段,利用转基因技术双光子显微镜可以实时动态连续观察神经递质受体的动态变化,随着双光子显微镜技术的发展还可以观察自由活动动物脑皮层结构功能和行为学的变化.神经示踪是现代研究神经环路(包括脑内及外周神经环路)重要的技术手段.光遗传和化学遗传对行为、生理及病理现象调控机制研究具有不可替代的作用,特别是和神经示踪技术结合应用对神经环路作用机制的研究尤为重要.光纤光度和光纤微透镜可植入脑内不同的多个脑区,观察自由活动动物不同脑区钙信号及神经递质探针信号和动物行为学的关系,是简单实用的神经光子学技术.

目的:首次使用双光子显微镜检测维持性血液透析(MHD)患者皮肤纤维组织变化,探讨皮肤瘙痒症与皮肤纤维组织变化的相关性.方法:纳入MHD患者147例,健康对照组43例.应用双光子显微镜检测受试者皮肤纤维组织成分及形态结构变化,计算皮肤弹性纤维与胶原纤维相对量比值(ELCOR).同时对皮肤瘙痒情况进行量表分析评估.结果:MHD患者皮肤出现弹性纤维退化,胶原纤维断裂,ELCOR值显著升高,且随透析时间增加而上升(P＜0.01).合并有皮肤瘙痒症的患者皮肤ELCOR显著升高(P＜0.01),且患者皮肤瘙痒程度与ELCOR正相关(r=0.397).血液透析+血液滤过+血液灌流治疗的患者皮肤ELCOR[1.119(1.079,1.181)]较血液透析、血液透析+血液滤过治疗、血液透析+血液灌流治疗的患者[1.573(1.339,2.059)、1.442(1.346,1.558)、1.419(1.326,1.487)]低,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:MHD患者皮肤弹性纤维/胶原纤维(ELCOR)升高与皮肤瘙痒症密切相关.血液透析、血液灌流和血液滤过三者联合治疗能显著降低ELCOR,改善皮肤瘙痒.

传统观点认为,中枢神经系统脑膜由硬脑膜、蛛网膜和软脑膜三层组成.该研究重新定义了教科书中的脑膜系统,发现了蛛网膜下腔中存在一类淋巴样膜(第4层脑膜),并将该腔室分为深浅两层,即蛛网膜下淋巴样膜 (SLYM).目的:探究SLYM能否形成非渗透性膜分隔蛛网膜下腔及其功能.结果:(1)首先,为了深入分析膜结构,该研究使用双光子显微镜观测了Prox1-EGFP+(Prox1:一种决定淋巴管发育的转录因子)小鼠皮层脑膜.

目的 探讨基质金属蛋白酶-8(MMP-8)对角膜的作用.方法 选取健康C57BL/6J小鼠15只,右眼角膜基质内注射10μL MMP-8作为实验组,左眼给予等量生理盐水作为对照组.于0、4、8h使用双光子显微镜二次谐波成像技术对活体小鼠角膜逐层扫描,Imaris软件对所得图像三维重建,计算图像信号强度.4、8h在裂隙灯下评价角膜混浊度.8h角膜取材,测定各角膜羟脯氨酸水平.结果 0h实验组及对照组小鼠角膜基质纤维信号强度分别为89.7±11.2、85.3±7.0,4h分别为14.5± 3.4、46.6±14.0,8h分别为11.0±4.6、34.6±12.5,4h及8h,实验组较对照组角膜基质信号强度明显降低(P<0.05);4h及8h,实验组较对照组角膜明显混浊(P<0.05);8 h测得实验组与对照组角膜羟脯氨酸水平分别为(0. 433±0.090)、(0. 590± 0. 133)μg/mg,实验组明显低于对照组(F=7. 193,P=0. 014).结论 MMP-8对小鼠角膜基质胶原有明显的降解破坏作用,导致角膜透明度下降.