目的 建立单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒的双重微滴式数字PCR检测方法.方法 基于单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒的保守区域,设计特异性引物探针,通过筛选引物探针组合,优化双重微滴式数字PCR反应退火温度及引物探针浓度比,建立双重单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒双重微滴式数字PCR检测反应体系,对其他病毒进行检测,对临床样本进行验证,对建立的双重微滴式数字PCR方法的灵敏性、特异性及重复性进行分析.结果 单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒双重微滴式数字PCR检测方法最佳引物和探针浓度分别为800 nmol/L和250 nmol/L,最佳退火温度是56℃;双重微滴式数字PCR检测方法的标准曲线相关系数(R2)为0.99,呈现良好的线性关系;灵敏度高,单纯疱疹病毒Ⅰ型最低检测下限为2.97拷贝/μL,水痘-带状疱疹病毒最低检测下限为2.73拷贝/μL;重复性好,变异系数小,检测结果稳定;特异性强,未发现与单纯疱疹病毒Ⅱ型、EB病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、巨细胞病毒、人巨细胞病毒、肠道病毒71型、流行性乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒以及人类核酸有交叉反应.结论 本试验建立的单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒双重微滴式数字PCR方法灵敏性强、特异性高、重复性好,可为不同场景下2种病毒的快速定量检测提供解决方案.

目的 为实现赤小豆加工食品的真伪和品质鉴别,建立赤小豆加工食品中被误用或混用的红豆成分实时荧光聚合酶链式反应(PCR)定性和微滴数字聚合酶链式反应(ddPCR)定量检测方法.方法 根据赤小豆和红豆基因组DNA中保守基因,分别设计适用于赤小豆和红豆成分实时荧光PCR定性检测的特异性引物探针,并设计适用于赤小豆加工食品中红豆成分双重ddPCR定量检测的通用引物探针,建立赤小豆加工食品中红豆成分质量百分比-DNA拷贝数浓度百分比线性关系式.结果 本方法对赤小豆和红豆基因组DNA检测低限分别为0.1和0.01 ng/μL,对赤小豆和红豆基因组DNA拷贝数浓度定量检测限均为6copies/μL,可对赤小豆加工食品中质量百分比为5％～80％的红豆成分准确定量.结论 本方法可用于赤小豆加工食品中红豆成分的定性和质量百分比定量检测.

目的 利用微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术建立可同时检测miR-888和miR-891a的体系,并评估其在精液鉴定中的应用价值.方法 通过设计不同荧光修饰的报告基团的水解探针实现对miR-888和miR-891a的双重ddPCR检测,对5种体液(外周血、月经血、精液、唾液、阴道分泌液)共75份样本进行检测,采用Mann-Whitney U检验进行差异性分析,通过ROC曲线分析评估miR-888和miR-891a区分精液的能力并获得鉴别的最佳截断值.结果 该体系双重检测与单独检测结果差异无统计学意义,检测灵敏度可达到0.1 ng总RNA,批内与批间变异系数均小于15％.经双重ddPCR检测,精液中miR-888和miR-891a的表达量均高于其他体液.经ROC曲线分析,miR-888的AUC为0.976,最佳截断值为2.250 copies/μL,判别正确率为97.33％;miR-891a的AUC为1.000,最佳截断值为1.100 copies/μL,判别正确率为100％.结论 本研究成功建立了双重ddPCR检测miR-888和miR-891a的方法,体系的稳定性和重复性良好,可用于精液鉴定,miR-888和miR-891a均具有较高的精液鉴别能力,且miR-891a的判别正确率更高.

目的 建立流行性乙型脑炎病毒(JEV)和西尼罗病毒(WNV)的双重微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法.方法 基于已设计的JEV和WNV引物探针,建立JEV和WNV双重ddPCR检测反应体系,摸索检测的敏感性、特异性和可重复性,灵敏度与双重荧光定量PCR(qPCR)的每个反应管内荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数(Ct)值做对比.结果 双重ddPCR检测反应体系对JEV和WNV的检测灵敏度均可达到102拷贝/μl,该方法的可重复性、特异性良好,未发现与登革病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、蜱传脑炎病毒以及人类基因组有交叉反应.结论 建立的双重ddPCR方法能敏感、特异检测JEV和WNV,为不同场景下这2种病毒的检测提供了解决方案.