微小残留病(MRD)是急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿最重要的预后指标。不同时间点的MRD检测结果，可提供不同临床信息。早期治疗阶段的MRD检测结果，可以反映ALL患儿的综合化疗效果，是其危险度分级的重要参考依据。目前，常用的MRD检测技术包括实时定量聚合酶链式反应技术(RQ-PCR)、多参数流式细胞术(MFC)、荧光原位杂交技术(FISH)和新技术。其中，RQ-PCR检测MRD的灵敏度较FCM高，但更为费时。临床应用中，应根据不同治疗目的，选择合适的MRD检测方法。数字微滴PCR(ddPCR)及二代基因测序(NGS)作为MRD检测的最新技术，可进一步提高MRD检测的灵敏度，在早期识别复发高风险的ALL患儿中更具优势。笔者拟就MRD与ALL患儿危险度分层诊疗的关系、MRD检测标本的选择、MRD检测方法及其选择进行阐述。

目的:探讨微滴式数字聚合酶链反应（ddPCR）在检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血循环肿瘤DNA（ctDNA）中表皮生长因子受体（EGFR）突变的应用价值。方法:收集山西省肿瘤医院2018年8月至2019年3月就诊的63例NSCLC患者外周血标本，采用ddPCR检测患者外周血EGFR敏感突变，并与对应组织扩增阻滞突变系统PCR（ARMS-PCR）检测结果比较。采用Kappa检验对两种检测方法一致性进行分析。结果:63例患者中，ddPCR共检测到EGFR敏感突变31例（49.2%），包括第18号外显子G719X突变1例（1.6%）、第19号外显子缺失（E19-Del）12例（19.0%）、第20号外显子T790M突变（T790M）11例（17.5%）、第21号外显子L858R突变（L858R）7例（11.1%）；31例突变患者中7例（22.6%）为双突变。ARMS-PCR检出上述4种突变26例（41.3%），依次有0例、12例（19.0%）、6例（9.5%）、8例（12.7%）；26例突变患者中双突变5例（19.2%）。1例患者ARMS-PCR检测L858R阳性而ddPCR检测L858R阴性。两种检测方法一致率为90.3%（κ=0.8，P<0.05）。31例ddPCR检测突变患者外周血ctDNA EGFR突变中位丰度1.7%（0.04%~23.60%），其中E19-Del中位丰度为2.5%（0.35%~22.70%），T790M突变中位丰度为0.6%（0.04%~14.00%），L858R突变中位丰度为2.3%（0.20%~23.60%）；ddPCR检测EGFR基因突变丰度<1%者10例，占所有突变者的32.6%（10/31），ARMS-PCR仅检出其中5例。接受酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗且发生获得性耐药的19例患者中，ddPCR检出T790M突变11例（57.9%），而无TKI用药史患者均未检测出此突变。11例T790M突变患者中，突变丰度<0.1%者1例，0.1%~2.0%者7例，>2.0%者3例。结论:ddPCR检测NSCLC患者外周血ctDNA中EGFR基因突变无创、快捷、灵敏度高且可绝对定量，为取样困难或因获得性耐药需重复取样肺癌患者进行EGFR-TKI靶向治疗提供了一个新的检测途径，个体化靶向治疗提供重要依据。

本文报道了1例利用微滴式数字聚合酶链反应（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）技术无创产前检测 MFN2基因变异致胎儿腓骨肌萎缩症的病例。先证者为孕妇配偶，外院基因检测结果为 MFN2基因（NM_014874）c.919A>G（p.K307E）杂合变异，诊断为轴索型腓骨肌萎缩症2A2A型。孕妇孕8周采集外周血提取胎儿游离DNA，采用ddPCR技术进行无创产前检测，检出胎儿携带父源性致病基因变异位点。孕11周采集绒毛进行Sanger测序验证，证实胎儿携带与父亲一致的c.919A>G（p.K307E）杂合变异。由本例提示ddPCR技术也许可以用于无创产前检测孕妇外周血中胎儿游离DNA是否携带父源性致病基因变异。

目的 探讨循环肿瘤DNA(ctDNA)中ESR1突变对激素受体阳性晚期乳腺癌内分泌治疗的影响.方法 选取53例激素受体阳性的女性晚期乳腺癌患者作为研究对象.采用微滴式数字聚合酶链反应(ddPCR)技术检测ctDNA中ESR1 Y537S和D538G的突变情况.根据ESR1的突变情况将患者分为ESR1突变组和ESR1非突变组,比较ESR1突变组与ESR1非突变组患者的临床特征,分析ESR1突变与内分泌治疗线数、治疗药物及无进展生存期(PFS)的关系.结果 53例患者中,ESR1突变患者为21例.ESR1非突变组的平均内分泌治疗线数明显少于ESR1突变组(P﹤0.01).ESR1突变组最常见的转移部位是骨和肝,且ESR1突变组的肝转移率高于ESR1非突变组(P﹤0.05).相较于传统的影像学或者肿瘤标志物评估方法,ctDNA可以平均提前70.1天发现肿瘤进展.ESR1非突变组患者的中位PFS为5.8个月(95％CI:2.9～8.7),ESR1突变组患者的中位PFS为4.6个月(95％CI:3.7～5.5),两组患者的中位PFS比较,差异无统计学意义(P﹥0.05).ESR1突变患者中,氟维司群治疗组患者的中位PFS为5.2个月(95％CI:3.9～6.4),长于非氟维司群治疗组患者的2.9个月(95％CI:0.6～5.3)(P﹤0.05).在≥三线的内分泌治疗中,氟维司群治疗组患者的中位PFS为5.2个月,长于非氟维司群治疗组患者的2.1个月(P﹤0.05).结论 ESR1突变是导致乳腺癌内分泌治疗耐药最常见的突变之一,利用ddPCR技术检测ctD-NA中ESR1的突变情况对及时发现内分泌治疗的耐药、选择合理的治疗方案具有重要的意义.

目的 探讨微滴数字聚合酶链反应(ddPCR)检测含有目的基因的PUC57质粒过程中出现的问题及解决方法.方法 用ECORⅠ酶37℃孵育含有目的基因的PUC57质粒2 h和4 h,然后65℃孵育20 min,灭活ECORⅠ酶.用伯乐QX200TM微滴式数字PCR分别检测PUC57质粒和经ECORⅠ酶酶切后的PUC57质粒,同时对酶切后的PUC57质粒分多天进行检测,对检测结果进行比较.结果 含有目的基因的PUC57质粒经ECORⅠ酶酶切2 h和4 h后的检测值与质粒理论值之间差异无统计学意义(t=-0.192、-0.403,P>0.05),同时酶切与没有酶切的PUC57质粒检测值之间差异有统计学意义(Z=-4.194,P<0.05).酶切后的检测值与PUC57质粒理论值相符合.酶切后的PUC57质粒随着放置时间的延长,检测值逐渐降低.结论 用伯乐QX200TM微滴式数字PCR检测含有目的基因的PUC57质粒时要先酶切再检测,酶切时间只需2 h即可将质粒酶切完全,同时酶切的PUC57质粒要尽快检测.

数字聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)采用与定量PCR相同的荧光化学原理和不同的数学原理来实现对靶标核酸序列的绝对定量,其摒弃了对外部参照的依赖,同时具有更高的数据精密度,提高了重复性和再现性.数字PCR的应用涵盖生命科学众多领域,特别是在医学检验领域,其对疾病相关核酸分子标记的准确分析,为疾病的早期诊断、进展监测、疗效评估提供了动态量化指标.数字PCR的出现将推动基于核酸扩增技术的分子生物学检测迈入精准定量阶段.本文就数字PCR尤其是微滴式数字PCR在感染性疾病中的应用进展及前沿进行综述.

1999 年 ,VOGELSTEIN 等[1]正式提出了数字聚合酶链反应(dPCR)的概念 . 目前 ,dPCR 主要分为 3类 :微反应室/孔板数字 PCR 、微流控芯片数字 PCR和微滴式数字聚合酶链反应 (ddPCR ) [1-3] . 其中 , ddPCR 是利用微滴发生器将反应体系一次性生成单分子水平的油包水微滴 ,再独立地进行循环扩增反应 ,扩增结束后分别对每个反应单元的荧光信号进行采集 ,有荧光信号的标记为"1" ,无荧光信号的标记为"0" ,使用泊松概率分布函数进行计算 ,最终得出反应体系最初的 DNA 拷贝量 . ddPCR 与实时荧光定量PCR(qPCR)采用相同的引物及探针 ,通过有限稀释法和泊松分布原理直接定量分析 ,计算出 DNA 水平 .这种技术无须依赖标准曲线和循环阈值(Ct 值) ,并且检测下限可低至单拷贝而达到真正意义上的绝对定量 .ddPCR 已被运用于低丰度和复杂来源的病原微生物核酸检测 、肿瘤标志因子检测 、拷贝数变异分析 、microR-NA 表达分析和无创产前检测等众多领域[4-7] .

目的 分析、比较聚合酶链反应(PCR)-荧光探针法、微滴式数字聚合酶链反应(ddPCR)法、Mas-sARRAY核酸质谱法和Sanger测序法检测甲状腺乳头状癌患者石蜡标本中BRAF V600E基因突变阳性率.方法 收集35例2013年手术切除的甲状腺乳头状癌石蜡标本(已知新鲜组织用PCR-荧光探针法检测BRAF V600E基因突变全阳性),分别采用PCR-荧光探针法、ddPCR法、MassARRAY核酸质谱法和Sanger测序法检测甲状腺乳头状癌石蜡标本中BRAF V600E基因突变情况.结果 35例甲状腺乳头状癌石蜡标本PCR-荧光探针法、ddPCR法、MassARRAY核酸质谱法和Sanger测序法检测BRAF V600E基因突变阳性率分别为80.0％(28/35)、94.3％(33/35)、74.3％(26/35)和60.0％(21/35).结论 对于需要进行回顾性分析的甲状腺乳头状癌石蜡标本,ddPCR法更适用于BRAF V600E基因突变的检测.

目的 探讨外周血循环肿瘤DNA(ctDNA)中原癌基因(KRAS)突变丰度变化对评估KRAS突变的局部晚期(cT3N1-2M0或cT4N0-2M0)结直肠癌患者新辅助治疗疗效的临床应用价值.方法 选取53例组织活检被诊断为KRAS突变且接受了新辅助治疗的局部晚期结直肠癌患者,利用微滴式数字聚合酶链反应(ddPCR)检测其接受新辅助治疗前、后外周血中ctDNA KRAS突变丰度,收集胸、腹、盆腔电子计算机断层扫描(CT)结果,检测血清癌胚抗原(CEA)及糖类抗原19-9(CA19-9)含量.结果 53例局部晚期结直肠癌患者接受新辅助治疗前、后外周血ctDNA KRAS突变频率(MAF)不同,差异有统计学意义(P<0.05);以MAF差值(治疗前MAF-治疗后MAF)为因变量,用最小显著性差异法(LSD)做MAF差值与影像学和病理学评效的比较分析,差异有统计学意义(P<0.05);血清CEA和CA19-9变化差值(均为治疗前-治疗后)与影像学和病理学评效的比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 外周血ctDNA KRAS突变丰度作为一种新的分子评效手段可有效补充传统的治疗评价标准,在反映局部晚期结直肠癌对新辅助治疗的效果中具有重要的临床意义.

背景与目的:结直肠癌是常见的消化道肿瘤之一,中国的结直肠癌发病率和死亡率都位居前列.循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)作为一种非侵入性检测标志物在结直肠癌患者全病程管理中具有一定价值.通过对转移性结直肠癌(metastatic colorectal cancer,mCRC)患者血浆ctDNA中相关基因突变状态进行检测和分析,可协助制定患者个性化治疗方案.方法:本研究纳入2016年6月—2017年1月复旦大学附属中山医院收治的30例mCRC患者,利用二代测序(next generation sequencing,NGS)和MALDI-TOF检测患者血浆ctDNA中KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA基因的常见突变.将两个平台数据相互比较,同时结合病史、组织活检结果和微滴式数字聚合酶链反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)得到的结果进行比较,评估本实验中NGS和MALDI-TOF检测的结果与综合获得的结果的符合率以及各自的阳性预测值和阴性预测值.结果:MALDI-TOF的符合率为76.67％,阳性预测值为86.67％,阴性预测值为66.67％.NGS的符合率为86.67％,阳性预测值为83.33％,阴性预测值为91.67％.结论:两个平台均可用于检测ctDNA中的常见突变,但NGS的阴性预测值要优于MALDI-TOF,同时突变位点丰度与原发灶是否手术切除以及患者是否接受过治疗有关.