目的:分析接受经皮冠状动脉介入治疗的冠心病患者CYP2C19基因突变情况及其对氯吡格雷抗血小板聚集的影响。方法:回顾性地选取2011年3月至2019年6月在南昌大学第二附属医院住院的冠心病患者，并选取同期遗传背景、性别、年龄与之相匹配的健康体检者作为对照。收集所有研究对象的基本临床资料及血液样本，提取DNA，采用Sanger一代测序法对冠心病患者及健康体检者行CYP2C19基因全外显子及外显子和内含子交界区测序以筛查CYP2C19基因变异。统计冠心病患者的基因变异发生率，并与千人基因组计划数据库和健康体检者的测序结果比较，以确定该基因变异是基因突变还是基因多态性。使用PolyPhen-2预测软件对基因突变进行有害性分析，以预测突变对蛋白功能的影响。在人正常肝脏细胞HL-7702中转染相同剂量的CYP2C19野生型质粒及筛查发现的CYP2C19基因突变质粒。转染24 h后，检测各组的CYP2C19蛋白酶表达量。将肝脏S9蛋白与氯吡格雷共孵育后作用于血小板，检测血小板聚集率和人血管舒张剂激活磷蛋白（VASP）活性。结果:共纳入1 493例冠心病患者和1 022名健康体检者，其中冠心病患者的年龄为（64.5±10.4）岁，男性1 129例（75.62%），健康体检者的年龄为（64.1±11.0）岁，男性778人（76.13%）。共在12例（0.80%）冠心病患者中共发现了5个CYP2C19基因突变，即4个已知突变T130K（1例）、M136K（6例）、N277K（3例）、V472I（1例）和一个新发突变G27V（1例），未在健康体检者中发现相应基因突变。T130K、M136K为很可能有害突变，G27V为可能有害突变，N277K和V472I为良性突变。体外研究发现，M136K基因突变组的血小板聚集率较野生型低24.83%（34.75%比59.58%， P<0.05），磷酸化VASP水平比野生型高23.0%（1.23比1.00， P<0.05）。而G27V、T130K、N277K、V472I等4个基因突变组血小板聚集率及磷酸化VASP水平与野生型比较差异无统计学意义（ P均>0.05）。 结论:在冠心病患者中共筛查出5个基因突变，即G27V、T130K、M136K、N277K、V472I。体外研究发现，CYP2C19基因突变M136K可增强CYP2C19蛋白酶对氯吡格雷的活化作用，进而抑制血小板聚集率，为功能获得型基因突变。

目的 通过构建HBV C基因型突变质粒研究HBsAg阴性HBV DNA阳性患者HBV S区突变对HBsAg水平的影响.方法 收集2022年8月至2023年4月首都医科大学附属北京佑安医院107例HBsAg-/HBV DNA+患者血液样本,对成功提取扩增的HBV DNA S区进行测序,通过构建HBV C基因型突变质粒对HBV S区突变位点进行细胞功能验证,探讨OBI可能发生的分子机制.结果 对成功提取扩增的68例患者进行测序,发现HBV S区存在大量突变,包括免疫逃逸突变(如sG145R、sK122R、sS114T、sT131P等)和跨膜结构域(transmembrane domain,TMD)突变(如sT5A、sG10D、sF20S等).通过构建HBV C基因型突变质粒,进行细胞转染和细胞免疫荧光实验发现sG145R突变会明显降低HBsAg的表达,但是sK122R、sI26N、sQ29N、sR169H、sS114T、sT131P这6个突变位点并未影响细胞内外HBsAg的表达.结论 通过测序发现HBsAg-/HBV DNA+患者HBV S区存在大量突变位点,通过构建sG145R、sK122R、sI26N、sQ29N、sS114T和ST131P等突变质粒发现sG145R突变会明显降低细胞内外HBsAg的表达,但是sK122R、sI26N、sQ29N、sR169H、sS114T、sT131P并未明显降低细胞内外HBsAg的表达.

目的 探讨前列腺癌中核纤层蛋白A/C(lamin A/C,LMNA)基因第七外显子点突变与LMNA表达差异的相关性.方法 采用高通测序分析了永生化正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)、低侵袭力前列腺癌上皮细胞(PC-3M-2B4)及高侵袭力前列腺癌上皮细胞(PC-3M-1E8)LMNA基因的12个外显子,识别出在RWPE-1与PC-3M-1E8细胞系中C.1159C＞ CA(p.L387LI)点突变,定位在1号染色体156106006.为了验证点突变在前列腺癌患者中的分布情况,PubMed GEO数据库下载了3组数据,分别是100例前列腺癌患者石蜡包埋标本的总RNA测序数据、20例前列腺癌和10例配对正常组织的转录组数据及21种前列腺正常及癌细胞株的测序数据.在1号染色体上选取156105950到156106055范围,设置比对序列CTACGCCTG或者NTACGCCTGTCCCCCAGCCC,每次分析比对长度为50 nt.同时,利用GEO数据库分析了突变点周围序列的特点与功能.最后,转染突变质粒,蛋白质电泳分析LMNA点突变对LMNA蛋白质表达的影响.结果 在所有分析的样品中,1号染色体LMNA外显子7从156106006到156106011的区域内,存在2种错义突变形式:C/CA(p.L387LI)、C/CG (p.L387LV)和4种同义突变形式:C/CT (p.L387L)、C/CA(p.R388R)、C/CT(p.R388R)、C/CG(p.R388R).前列腺癌按格里森(Gleason score,GS)评分系统分组,错义突变的总发生率分别占40％(正常)、11％(GS5-6)、2％ (GS 7)和6％ (GS 8-10).在16种前列腺癌细胞系和5种前列腺良性细胞系中,错义突变的总发生率分别占31％和60％.此外,还发现1号染色体上从156106008到156106066是转录因子结合位点,常见转录因子为PAX5、HEN1(NHLH1)、HTF、P53、MIF1、COMP1和NGFIC (NGF4).通过功能聚类分析,这些转录因子的功能主要集中在染色质重组及调控、RNA代谢过程的正向调节、组蛋白修饰的调控以及程序性细胞死亡的负调节等方面.高表达突变LMNA的细胞系LMNA及磷酸化LMNA蛋白质表达下调.结论 156106006位点突变多发生在前列腺正常组织和前列腺良性细胞株,与LMNA蛋白质表达密切相关,可能是lamin蛋白质异源性表达的机制之一.

目的:探讨丙戊酸钠对人血清类黏蛋白1样蛋白3 (ORMDL3)转录表达的影响及其机制.方法:利用RT-PCR测定丙戊酸钠对人ORMDL3 mRNA表达的影响;通过点突变、双光荧素酶报告基因分析方法确定丙戊酸钠对ORMDL3启动子活性的影响及其作用机制.结果:在人胚肾293细胞(HEK293)中,丙戊酸钠(终浓度2 mmol/L)可明显降低哮喘ORMDL3基因的表达量.荧光素酶分析结果显示:丙戊酸钠能够明显抑制ORMDL3基因的启动子活性;对人ORMDL3核心启动子区正向调控OR-MDL3表达的p300 、CREB位点逐个突变后,丙戊酸钠对突变质粒的降低作用较野生型质粒无显著性差异.结论:丙戊酸钠可下调HEK293细胞ORMDL3转录表达水平,此调节作用并非通过降低与ORMDL3核心启动子区p300和CREB位点的结合而发挥.

嗜冷菌和耐热菌是奶粉加工过程中最主要的微生物污染菌群.嗜冷菌在原料乳低温储藏过程中大量繁殖,其生长过程中伴随着脂肪酶和蛋白酶的产生,不仅对原料乳和乳制品的风味品质有很大影响,也是导致原料乳和乳产品发生酸包、乳清分离等腐败变质的重要原因.在奶粉生产过程中,耐热菌不仅能在奶粉中长期存活,而且也能够产生大量的蛋白酶、脂肪酶等各种酶类,可显著降低奶粉的感官品质与营养价值.本文重点介绍奶粉加工过程中嗜冷菌和耐热菌的多样性、对奶粉品质的影响机制、及其检测方法和控制措施.

目的:探究从原料奶样品中分离到的480株嗜冷菌(鉴定为24个属、74个种,并根据随机扩增多态性DNA(RAPD)图谱特征聚类为85组)在室温和低温下产腐败酶的能力,以及这些腐败酶的耐热性.创新点:系统地分析和比较不同种类的嗜冷菌在室温和低温下产腐败酶的能力,并探究这些腐败酶的耐热性,为控制乳制品和其它低温储藏食品的腐败变质提供理论基础.方法:采用不同的筛选培养基评估480株嗜冷菌在室温(28℃)和低温(7℃)产蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶及 β-半乳糖苷酶的能力;根据初筛的结果分别以偶氮酪蛋白和对硝基苯酚棕榈酸酯为底物定量测定蛋白酶和脂肪酶的酶活力;挑选酶活力高的蛋白酶和脂肪酶,分别测定经70、80和90℃ 条件下处理一段时间后的残留酶活计算出热稳定性,并根据热动力学公式计算相关的热力学参数.结论:Pseudomonas、Serratia及Chryseobacterium产蛋白酶的能力强,而Yersinia intermedia产蛋白酶的活力最高;Acinetobacter产脂肪酶的能力强,其中Acinetobacter guillouiae产脂肪酶的活力最高;而一些特定的属能产生 β-半乳糖苷酶及磷脂酶.细菌产腐败酶的能力在种水平上表现出差异性(如Pseudomonas fluorescens和Pseudomonas fragi).大量的蛋白酶及脂肪酶即使经高温热处理后仍有酶活残留,且所得的热灭活动力学的参数证实这些腐败酶经常规方法灭菌后仍对乳制品的品质及货架期有潜在的危害.

参加宁波市人大讨论市政府工作报告,发言涉及“完善财政拨付与医院绩效挂钩机制”时,就在想医疗绩效考核在政府层面上当如何设计,才能真正反映医疗的社会功能与医务工作的社会价值,因为,医务工作不只是一个技术活,更是一个良心活,若单从技术层面上去设计绩效考核,显然难以全面地反映医疗存在的实际价值与功能,甚至可能会引导医疗行为的跑偏,如何设计出一个能充分引导医疗良心“从良”的好制度,既需要政府的智慧,又需要政府的魄力.相信制度引导良心“从良”不仅限于医疗行业,因为,各行各业同样也渗透着良心的败坏,如食品行业的有毒、有害、变质、参假;化工、冶金等行业的环境污染与过度开发等等.是的,没有哪一个行业不涉及良心,良心一旦玷污、变质,危害就不可避免.只是,一些是间接的,一些是直接的;一些是快速呈现的,一些则是缓慢表达的;一些危害轻些,一些危害重些.就医疗而言,直接做在人的身上,又都是些病弱的患者,良心的呈现就会更直接、更快速也更清楚一些.

目的 将Toll样受体(TLR4)野生型及突变型(包括单突变和双突变)基因分别转入HepG2细胞,建立稳定表达TLR4蛋白的细胞株.方法 PCR扩增用于合成TLR4的cDNA,设计引物应用PCR点突变的方法合成1196T及896G单突变质粒和TLR4-1196T,896G双突变质粒.经慢病毒包装后,将合成的pLVX-TLR4-Puro、pLVX-TLR4(A-G)-Puro、pLVX-TLR4(C-T)-Puro、pLVX-TLR4(A-G,C-T)-Puro质粒转染HepG2细胞.在细胞贴壁后加入嘌呤霉素进行筛选;Western blot检测各组细胞TLR4的表达量.结果 嘌呤霉素筛选出含有抗性基因的细胞,说明TLR4重组质粒成功转入细胞;Western blot结果表明TLR4在HepG2细胞中稳定过表达.结论 成功构建了4组TLR4过表达的细胞株,为研究TLR4基因多态性对HepG2细胞生物学功能的影响奠定基础.

目的 融合PCR法构建棘皮动物微管相关蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule associated protein like 4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK)G1202R点突变载体,并构建体外克唑替尼耐药细胞模型.方法 利用RT-PCR从H2228细胞中获得EML4-ALK融合基因,随后利用融合PCR技术构建EML4-ALK-G1202R点突变融合基因,酶切后定向连入真核表达质粒pEGFP-N1中,构建pEGFP-N1-EML4-ALK-G1202R重组质粒.脂质体法将重组质粒转入A549细胞中,G418抗生素筛选构建EML4-ALK-G1202R稳定高表达细胞系.MTT法验证细胞模型对克唑替尼的耐受性.结果 测序结果表明EML4-ALK-G1202R点突变正确,Real time-PCR和Western blot检测结果表明稳转细胞系构建成功,MTT结果表明克唑替尼耐药模型构建成功.结论 成功构建了pEGFP-N1-EML4-ALK-G1202R真核表达载体,转染A549细胞后,可稳定表达并发挥克唑替尼耐药性,为进一步研究EML4-ALK点突变导致的细胞耐药机制奠定了基础.

目的:采用盐水腌制干燥技术,使新鲜的白芷在产地快速干燥,避免腐烂和霉变,获得一种白芷药材.方法:取稍蔫的新鲜白芷,除去泥土,整齐地放置在容器中,用压石压住,加入盐水,浸过白芷,腌制1～2d,将预处理的盐水倒出,加入与预处理时几乎等量的盐水,密封,腌制一段时间,取出白芷,用水反复浸泡和淋洗,晾干,即可获得白芷药材.结果:采用盐水腌制法加工的白芷中指标成分、醇溶性浸出物含量等指标均达到了2015年版《中国药典》对白芷药材的质量规定,所有样品中亚硝酸盐质量分数均低于3.3 mg·kg-1(检测限),符合盐渍品中亚硝酸盐的限量指标.结论:在产地采用盐水腌制法获得的药材白芷,在简易仓库中贮藏2年未见变质现象,为中药白芷的产地加工提供了一条新技术.