传统腹腔镜手术通过向腹腔注入气体以创造手术视野、建立手术平台,CO2因其无色无味、无毒性、不可燃、刺激性小、导热性差、热稳定性高、方便获取、可溶于水、弥散性好等特性成为气腹首选气体,但CO2气腹可引起腹腔内压力增高、血流动力学波动、高碳酸血症、心律失常、静脉血栓、气体栓塞、肺内分流甚至肺不张等问题[1].

目的 探讨新型量子点荧光免疫层析法测定血清淀粉样蛋白A(SAA)的应用.方法 采用双抗夹心法结合量子点荧光免疫层析技术制备以二硝基苯酚(DNP)-牛血清白蛋白(BSA)系统为质控线的SAA检测试剂盒.通过鸡IgY-羊抗鸡IgY系统作为对照评价了 DNP-BSA系统作为质控线的可行性,并通过优化量子点微球与抗体的偶联条件,进一步提高试剂盒的性能,并对试剂盒的空白限、检出限、线性范围、精密度、准确度、特异度、稳定性,以及临床实际样本测定等方面进行了评价.结果 以DNP-BSA系统作为质控线的SAA试剂盒受干扰成分浓度的影响小,稳定性高,热稳定性好.量子点微球与SAA抗体偶联比例为100 μg/mg,偶联反应液浓度为25 mmol/L 3-吗啉丙磺酸pH 7.4,与DNP-BSA偶联比例为100 μg/mg,偶联反应液浓度为25 mmol/L吗啉乙磺酸pH 6.0时偶联效果最佳.试剂盒最低检出限为0.5 mg/L;线性范围为1～200 mg/L,R2≥0.99;批内精密度变异系数(CV％)≤5.31％,批间精密度CV％≤15％;在低、高浓度的回收率分别为101.42％、98.83％;在血红蛋白浓度≤5 g/L,胆红素浓度≤0.15 g/L,胆固醇浓度≤15 g/L,甘油三酯浓度10 g/L时,SAA的检测结果无干扰;试剂盒在50 ℃放置21 d,稳定性良好;试剂盒与Roche的SAA电化学发光试剂盒同步检测67例样本结果具有高度一致性.结论 研制的SAA检测试剂盒灵敏度、线性、精密度、准确度、特异度及加速稳定性都满足试剂盒的要求,与鸡IgY-羊抗鸡IgY系统相比DNP-BSA系统作为质控线独立性好,测定临床样本准确度和热稳定性更佳.

目的 制备靶向抗T细胞免疫球蛋白-ITIM结构域蛋白(T cell immune receptor with Ig and ITIM domains,TIGIT)和脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域蛋白(Poliovirus re-ceptor-related immunoglobin domain-containing protein,PVRIG)双特异抗体,探究其体外生物学活性.方法 用PVRIG人源化抗体hP1和TIGIT人源化抗体hT1构建KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV双特异性抗体,将纯化得到KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体进行SDS-PAGE凝胶电泳、热稳定性检测和稳定性分析;采用流式细胞术(Fluorescence activated cell sor-ting,FACS)检测双特异性抗体的结合活性;采用生物干涉膜技术(Bio-layer interferometry,BLI)检测双特异性抗体亲和力;用 Jurkat-NFAT-Luc2-PD1-TIGIT-PVRIG 细胞和 293T-OS8-PVRL2-PDL1细胞中检测双特异性抗体KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV对于TIGIT/PVRIG靶点的阻断作用;采用CMV recall assay法检测IFN-r在上清液中的浓度.结果 SDS-PAGE凝胶电泳结果显示KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV双特异性抗体纯度＞95％;Tm结果为Tm1:66.34,Tm2:80.95.采用SEC-HPLC对双特异性抗体KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV进行稳定性分析,其纯度均＞90％.KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体和PVRIG的人源化抗体hP1与293T-PVRIG cell line 的 EC50 分别为 0.168 70 μg/mL 和 0.038 65 μg/mL,与 293T-cyno-PVRIG cell line 的 EC50 分别为 0.037 14 μg/mL 和 0.031 98 μg/mL,与 Human PVRIG Protein,His Tag的亲和力为 1.74E-10M 和 1.69E-10M.KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV 抗体和 TIGIT 的人源化抗体 hT1 与 293T-PVRIG cell line 的 EC50 分别为 0.070 27 μg/mL 和 0.031 21 μg/mL;与293T-cyno-TIGIT cell line 的 EC50 分别为 0.020 28μg/mL 和 0.028 22 μg/mL;与 Human TIGIT Protein,His Tag 的亲和力为 8.50E-10M 和 8.47E-10M.KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV 抗体具有阻断 PD1/PDL1/TIGIT/PVRIG 相互作用活性,且 KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV 的 EC50为 0.007 μg/mL,优于单独人源化抗体 hT1(EC50为 0.013 μg/mL)和 hP1(EC50为 0.048 μg/mL)的作用.在含 pp65 peptide 条件下 KY-TIGIT-h1gG4M-PVRIG-SCFV 抗体分泌 IFN-r 为 349.72 pg/mL,明显高于其他抗体.结论 KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体具有高亲和力和良好的生物学活性,有望开发成为肿瘤免疫治疗的抗体药物.

目的:研究传统中药材全蝎三种热稳定性多肽BmKcug2、BmKcug2-P1 和Martentoxin-P2 的消化酶抗性.方法:结合重组表达、消化酶耐受实验、高效液相色谱技术及结构分析,评价多肽BmKcug2、BmKcug2-P1 和Martentoxin-P2 的肠胃蛋白酶稳定性.结果:多肽BmKcug2 对胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶都有很好的稳定性;多肽BmKcug2-P1 对胃蛋白酶稳定性较好,对胰蛋白酶也具有一定的抗性,但对α-胰凝乳蛋白酶稳定较差;多肽Martentoxin-P2 的酶稳定性谱与BmKcug2-P1 类似.结论:本研究发现了全蝎毒腺中存在多肽能够耐受肠胃蛋白酶的消化作用,阐明了全蝎毒腺中多肽的消化酶稳定性,为深入研究全蝎中有效药用成分提供了思路,为系统研究全蝎多肽活性成分和口服给药途径之间的关系奠定了基础.

目的:构建共表达P1和3CD的重组杆状病毒，利用昆虫细胞重组表达2型脊髓灰质炎病毒(poliovirus type 2，PV2)的病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)，制备PV2-VLP进行初步免疫原性研究。方法:基于粉纹夜蛾细胞(High 5)密码子偏好性，将PV2的P1基因和3CD基因进行序列优化，并对P1基因进行稳定性突变，构建突变型rBac-PV2-P1s-3CD和野生型rBac-PV2-P1-3CD杆状病毒。Western blot分别检测目的蛋白表达量，离子交换层析纯化PV2-VLP，透射电镜观察VLP高级结构确定组装效率。免疫大鼠评估免疫原性。结果:成功构建了可稳定表达P1s蛋白和3CD蛋白的重组杆状病毒。Western blot结果表明热稳定性突变后VLP产量相比野生型有所提高。电镜观察发现直径约30 nm的三维结构，表明VLP成功组装。动物实验结果表明，重组制备的PV2-VLP具有免疫原性，且能有效刺激产生中和抗体。结论:用昆虫细胞-杆状病毒表达系统可成功制备有效的VLP类疫苗，为PV-VLP疫苗的研制提供参考。

目的:考察聚多巴胺改性胶原膜复合材料对软骨组织的黏合力及对软骨细胞增殖的影响，进一步探讨其在自体软骨细胞移植中应用的可能性。方法:制备胶原膜材料，通过吸附法构建聚多巴胺改性的胶原膜复合材料。通过红外光谱仪、热重分析仪、差示热分析仪、扫描电镜和X射线光电子能谱仪等分别对复合材料的热稳定性、热学性质、多孔结构和表面元素组成等理化性质和结构特征进行表征；通过力学试验机测试聚多巴胺改性的胶原膜与新鲜软骨组织间的黏附力；通过体外细胞培养方法考察复合材料对兔软骨细胞黏附和增殖的影响。结果:复合材料结构和表面元素组成随聚多巴胺吸附时间的增加而变化，聚多巴胺吸附量随复合时间延长而增加；聚多巴胺的复合对胶原膜材料的热稳定性和热学性质无明显的影响；复合材料对软骨组织的黏附力随聚多巴胺吸附量的增加而增强；复合材料对软骨细胞具有时间相关性地促进作用。结论:聚多巴胺改性胶原膜复合材料在关节软骨修复中具有潜在的应用价值，但用于关节软骨修复之前，需要更多的研究来优化复合材料。

目的:构建可快速、灵敏、定量检测肺炎支原体(MP)免疫球蛋白(Ig)M和IgG抗体的时间分辨荧光免疫层析法(TFICA)。方法:基于毛细管作用，应用铕微球示踪，通过对抗原/抗体微球偶联比、微球稀释度、划膜浓度和血清稀释度进行优化，建立检测MP-IgM和IgG抗体的TFICA，并考核其方法学性能(如灵敏度、特异性、稳定性)。通过对55名健康体格检查者进行检测获得TFICA的正常参考值；采用TFICA与市售化学发光法试剂盒分别检测88名受试者(33例患者，55名健康体格检查者)的血清样本，计算结果一致性( Kappa检验)。 结果:反应条件为：鼠抗人IgG抗体和MP抗原与微球分别按质量比1∶20和1∶100反应，微球工作稀释度分别为1∶200和1∶100；MP抗原和羊抗人IgM的划膜浓度分别为0.5和1.0 g/L；血清稀释度均为1∶300。建立的MP-IgM和IgG TFICA测量范围分别为(0.78~70.00)×10 3相对单位(RU)/L和(0.17~200.00)×10 3 RU/L，检测灵敏度分别为0.78×10 3和0.17×10 3 RU/L，与甲状腺过氧化物酶抗体、心磷脂酶抗体、甲状腺球蛋白抗体均无交叉反应；相对标准偏差分别为3.7%~14.8%和2.9%~14.0%。经37 ℃ 5 d快速老化，MP-IgM和IgG TFICA试剂的平均信号降低率分别为13.7%和14.2%，提示热稳定性好。该法正常参考值分别为3.33×10 3和2.61×10 3 RU/L；与市售化学发光试剂盒检测结果的 Kappa值分别为0.79和0.76。 结论:TFICA检测MP-IgM和IgG抗体具有操作简捷、灵敏度高、特异性好、可定量的优点，具备一定的临床应用价值。

目的:制备能与VirB12抗原高亲和力结合的新疆双峰驼纳米抗体，为后续研究奠定基础。方法:采用VirB12重组蛋白6次免疫新疆双峰驼，从外周血中分离得到淋巴细胞后提取总RNA，通过巢式PCR扩增VHH基因片段构建噬菌体VHH展示文库。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）固相亲和富集方法进行筛选。进行3轮亲和筛选后随机挑取出第2、3轮富集的克隆，ELISA分析可溶性表达的纳米抗体与VirB12蛋白的结合情况。经过序列测定和多重比对去除重复序列，最后得到个5非冗余序列，分别命名为D1、E6、H8、H9和H10。将筛选鉴定的5个纳米抗体基因转化WK6菌株，在16 ℃下进行胞间质可溶性表达，经Ni亲和柱纯化表达后，Western Blot和ELISA法检测纳米抗体与VirB12抗原的结合能力与热稳定性。结果:经VirB12蛋白免疫后的血清抗体效价最少为1∶24 000。从VirB12抗原免疫的新疆双峰驼淋巴细胞中获得了滴度为2.8×10 8 cfu/ml的VHH噬菌体展示文库。5株纳米抗体在WK6菌中以可溶形式表达。结果表明，5株抗VirB12纳米抗体质量分数接近90%，且具有较高的抗原结合活性与明显的抗原-抗体浓度相关性；4株纳米抗体均表现出较高的热稳定性，在90 ℃处理后，仍能保留60%以上的结合活性。 结论:通过固相筛选富集和可溶性单克隆检测鉴定获得了5株具有较高亲和力和热稳定性的抗VirB12纳米抗体，为VirB12纳米抗体的进一步开发奠定了基础。

目的:制备特异性抗镰刀菌鸡卵黄抗体(IgY)并检测其对温度和pH的耐受性及抗真菌作用。方法:取22周龄莱杭母鸡18只，采用随机数表法将其随机分为阴性对照组和实验组，每组9只。制备灭活镰刀菌丝悬液，将菌丝浓度2×10 7菌落形成单位(CFU)/ml的菌悬液与弗氏完全佐剂等体积混合充分乳化后，对实验组莱杭母鸡进行免疫，每只鸡注射1 ml，2周后换为弗氏不完全佐剂加强免疫。在免疫后的第5~16周每周收集卵黄，用硫酸铵盐析法制备IgY，将得到的蛋白溶液放入冻干机中制作成冻干粉，4 ℃保存。以质量分数0.9%氯化钠溶液代替菌悬液按照同样方式进行阴性对照组莱杭母鸡的注射，以制备非特异性抗体作为实验中的阴性对照。采用考马斯亮蓝法测定特异性IgY蛋白浓度，采用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定其效价。将1×10 5 CFU/ml和1×10 3 CFU/ml镰刀菌悬液与不同浓度IgY及磷酸盐缓冲液(PBS)混合培养4 d后测定吸光度( A)值，用PBS及非特异性IgY与镰刀菌悬液共孵育作为空白对照组及阴性IgY组，绘制抗镰刀菌IgY的抑菌曲线。用pH 7.4的PBS将特异性IgY溶液稀释至0.02 mg/ml，分别在30、40、50、60、70、80和90 ℃水浴中孵育30 min后冷却至室温；此外，用pH值为l、2、3、4、5、6、7、8、9、l0、11和12的PBS将特异性IgY溶液稀释至0.02 mg/ml，4 ℃下放置1 h，均采用间接ELISA法测定抗体活性，评估IgY对不同温度和pH的耐受性。取SPF级8周龄雌性C57BL/6小鼠12只，采用随机数表法将其分为PBS对照组和特异性IgY治疗组，每组6只。用镰刀菌感染小鼠右眼角膜，建立小鼠真菌性角膜炎动物模型，建模后1 d，特异性IgY治疗组用200 mg/ml特异性抗镰刀菌IgY点眼，PBS对照组用PBS点眼，于感染后1、3和5 d在裂隙灯显微镜下观察小鼠角膜，根据炎症评分表对真菌性角膜炎的严重程度进行评分。 结果:免疫后第5~16周的IgY蛋白质量浓度分别为1.57、2.89、24.98、25.09、23.89、25.78、21.57、21.37、18.98、15.78、14.67和12.67 mg/ml。特异性抗镰刀菌IgY的效价从第5周开始升高，第7周时达到最高效价，为1∶10 000，可维持至免疫后12周，12周后抗体效价逐渐下降。抑菌曲线显示，与空白对照组和阴性IgY组相比，特异性IgY治疗组镰刀菌生长缓慢。抗体效价高于1∶10 000的特异性IgY在60 ℃以下具有较好的热稳定性；在pH 4~6具有最高活性，在pH 3~9的免疫活性能够保持在70%以上，随着pH值的进一步降低或升高，其活性迅速降低。镰刀菌感染后1、3和5 d，PBS对照组角膜炎症评分分别为3.50±0.55、7.33±0.82和4.00±0.63，特异性IgY治疗组角膜炎症评分分别为3.33±0.82、4.17±0.75和2.50±0.55。2个组不同时间点炎症评分总体比较，差异均有统计学意义( F分组＝247.35， P<0.05； F时间＝23.19， P<0.05)，其中镰刀菌感染后3 d和5 d，与PBS对照组相比，特异性IgY治疗组小鼠真菌性角膜炎炎症评分降低，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:用硫酸铵盐析法可成功制备高效价特异性抗镰刀菌IgY，其稳定性高，对温度和酸碱度均有一定的耐受性，可以在小鼠的真菌性角膜炎模型中减轻角膜溃疡的严重程度，降低炎症评分。

目的:采用Box-Behnken设计方案、响应曲面设计法(RSM)优化陈皮挥发油β-环糊精微球包合物的制备工艺，考察其物理表征及热稳定性。方法:采用反相乳液聚合法和饱和水溶液法，以挥发油与微球投料比、微球与水投料比、包合温度为影响因素，包合率为响应值，建立回归模型，优化制备工艺。通过显微、红外、差示扫描量热法和热稳定性试验，表征陈皮挥发油β-环糊精微球包合物。结果:陈皮挥发油β-环糊精微球包合物的最佳制备工艺为：挥发油与微球投料比为1∶10( V∶m)、微球与水投料比为1∶15(m∶ V)、温度41 ℃，平均包合率为62.21%，平均产率为85.24%。物理表征和热稳定试验表明包合物成功且热稳定良好。 结论:优化所得的陈皮挥发油β-环糊精微球包合物的制备工艺可行。