脂肪酶属于常见的生物催化剂,当前已经在医药和生物化工领域得到了广泛应用,但是由于游离脂肪酶的稳定性较差,很容易受外界环境因素影响,不能有效重复使用,故而对酶催化的效率和效果造成了不利影响.基于此,文章对脂肪酶的固定化技术展开详细分析,并研究其在药物合成领域的应用,旨在为提升脂肪酶的固定化处理效果和提高其在药物合成中的应用水平提供助力.

采用模板法结合辛基(C8)表面修饰制备疏水有序介孔SiO2 载体(OMS-C8),在此基础上制得固定化脂肪酶(CSL@OMS-C8),成功应用于乙酸肉桂酯的无溶剂酶法制备.利用扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)、N2-吸附脱附、傅里叶红外(FTIR)对载体材料和固定化酶进行表征.结果显示,OMS具有整齐有序的介孔结构,比表面积达 149.9 m2/g,平均孔径为 15 nm.经过疏水改性后,接触角从 20°提高到 120°.优化获得了乙酸肉桂酯的最佳反应条件为温度 50℃,肉桂醇与乙酸乙烯酯的摩尔比 1∶5,固定化酶添加量 2 g/L,反应时间 2 h,转化率达到 96.6%.催化剂经过 5 次重复使用肉桂醇的转化率仍能达到 80%.

以海藻酸钠、羧甲基纤维素钠(CMC)为载体,分别以乙二醇缩水甘油醚(EGDE)和戊二醛为交联剂,采用包埋交联法对脂肪酶进行固定化,结果显示EGDE的交联效果要优于戊二醛,添加EGDE的固定化酶酶活最好.得到制备固定化酶的最优方案为海藻酸钠2.5％,CMC浓度1.5％,给酶量800U/ml复配载体,氯化钙5％,以0.02％的EGDE交联固定30min,由此制备得到酶活约为380 U/g的固定化酶,酶活收率约为50.09％.固定化酶的最适反应pH为8.5,比游离酶增大0.5个单位;最适反应温度是45℃,比游离酶提高5℃;耐热性能变好,且重复使用7次后仍能保持60％左右的相对酶酶活.

为提高酶促合成L-抗坏血酸棕榈酸酯的效果,采用物理吸附法,将黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase,ANL)固定在瓶壁、脱脂棉上,制得固定化酶(器壁-ANL、脱脂棉-ANL),并催化L-抗坏血酸(Vc)与棕榈酸酯化反应合成Vc棕榈酸酯.结果发现,在37℃、转速160 r/min、Vc和棕榈酸摩尔比1:3、反应24 h、丙酮为溶剂的条件下,器壁-ANL和脱脂棉-ANL催化反应的摩尔转化率分别为87.3％和90.4％.同样条件下,酶粉催化反应转化率不足36％.底物摩尔比为1:1,器壁-ANL、脱脂棉-ANL催化反应的转化率分别为51.5％和62.2％.从生产的角度来看,脱脂棉-ANL催化,丙酮为溶剂、底物等摩尔比的反应体系具有低碳、环保和产物易提纯的特性,通过进一步提高转化率,更具工业应用价值.

目的:探究国产环氧树脂LX-120固定化脂肪酶的工业化应用潜力.方法:使用环氧树脂LX-120对脂肪酶进行共价固定化研究,通过正交实验优化了固定化条件并考察了固定化酶的操作稳定性.结果:最佳固定化条件为:反应时间3 h,反应温度30℃,pH 6.5,给酶量600 U.由上述条件制备所得的固定化酶酶活为(357.03±7.09)U/g,酶活回收率高达95.42％.与游离酶相比,固定化酶的热稳定性和酸碱稳定性均有明显提升.连续反应10次,固定化酶的酶活仍保留64.21％,操作稳定性较好;4℃下储存30 d,固定化脂肪酶仍保留78.14％的活力.结论:环氧树脂LX-120在脂肪酶等工业酶的固定化技术中有较好的应用前景.

目的:探讨双相水凝胶组织固定联合脂肪酶浸泡对小鼠肝组织透明化的影响.方法:取10只昆明小鼠的肝组织,利用双相水凝胶进行固定,切取1 mm厚的肝组织10片,将其随机分为十二烷基硫酸钠(SDS)组和SDS+脂肪酶组.SDS组采用SDS清除液进行被动脂质清除9 d,SDS+脂肪酶组先采用SDS清除液被动脂质清除5 d,随后浸泡于脂肪酶溶液中4 d.两组于清除前、清除后第1天至第9天均进行透明灰度值测定,于脂质清除完毕后予以细胞核DAPI染色检测标记深度.结果:在被动脂质清除过程中,第1天至第5天肝组织薄片的透明灰度值逐渐提升,但之后肝组织片清除速度缓慢,在第10天的清除仍然是不透明的;在第7、第9天,两组相对透明灰度值比较,差异有统计学意义(P<0.01);SDS+脂肪酶组DAPI染色深度达115μm,而SDS组DAPI染色深度达60μm,SDS+脂肪酶组DAPI渗透深度是SDS组的1.92倍.结论:双相水凝胶组织固定联合脂肪酶浸泡脂质清除技术可以快速实现小鼠肝组织透明化,为肝组织生物学研究提供技术支持.

脂肪酶是一类重要的工业用酶,广泛应用于诸多工业领域.与游离脂肪酶、物理或化学固定化脂肪酶相比,全细胞脂肪酶具有制备简单、无需蛋白质提取纯化、天然固定化、稳定性及抗逆性更好、制备及设备成本较低等优点,因此以全细胞形式利用脂肪酶被誉为是最有前景的降低生物转化成本的方法之一,关于全细胞脂肪酶的研究一直是脂肪酶领域的热点.就全细胞脂肪酶的研究进展进行归纳和述评,包括野生型全细胞脂肪酶和基因工程全细胞脂肪酶,并对其未来研究方向做出展望,以期为后续研究提供有益参考.

该实验首先采用羧基磁珠固定化胰脂肪酶筛选出夏枯草中可能的胰脂肪酶抑制剂,然后通过LC-MS/MS鉴定,标准品比对确认,最后采用对硝基苯酚法测定抑酶活性及抑制类型.结果:从夏枯草中共筛选出4个胰脂肪酶抑制剂,并经过了LC-MS/MS鉴定和混合对照品确认,其IC50和抑制类型分别为咖啡酸[(252.3±3.6) mg·L-1,反竞争性抑制]、芦丁[(91.2±1.6) mg·L-1,竞争性抑制]、橙皮苷[(31.5+4.4) mg·L-1,竞争性抑制]、熊果酸[(41.3±2.2) mg·L-1,竞争性抑制].4抑制剂抑制类型与抑酶活性与其分子空间大小、疏水性和氢键数目,特别是与PL三联体形成氢键数目相关.

利用大孔吸附树脂DA-201为载体对海洋脂肪酶固定化, 并探寻添加剂对固定化过程的影响.分别以NH4Cl、甘露糖和甘氨酸为添加剂, 采用单因素和正交实验相结合的方法优化条件.结果显示, 以NH4Cl为添加剂的最优条件:柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH 6. 0, 固定化温度30℃, 载体投放量0. 5g, NH4Cl浓度25mmol/L, 固定化时间3. 0h, 酶活力达到115. 27U/g;比不含有添加剂的固定化酶固定化效率提高47. 42％.以甘露糖为添加剂最优条件:磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液pH7. 0, 固定化温度35℃, 载体投放量0. 5g, 甘露糖浓度10mmol/L, 固定化时间4. 5h;酶活力达到122. 75U/g, 比不含有添加剂的固定化酶固定化效率提高6. 50％.以甘氨酸为添加剂的最优条件:磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液pH7. 0, 固定化温度20℃, 载体投放量0. 5g, 甘氨酸浓度为25mmol/L, 固定化时间7. 5h;酶活力达到141. 69U/g, 比不含有添加剂的固定化酶固定化效率提高26. 12％.采用不同添加剂对大孔吸附树脂DA-201的吸附固定化过程有较大影响, 可以极大地提高吸附效率;同时发现缓冲液类型、pH、温度、添加剂浓度和固定化时间等对DA-201树脂吸附脂肪酶有很大影响, 对后续吸附固定化工业酶研究有较好的参考价值.

目的:使用双功能环氧交联剂新戊二醇二缩水甘油醚和硅藻土载体固定化海洋脂肪酶,并探究固定化酶的酶学性质.方法:采用先交联后吸附的方法固定化海洋脂肪酶,交联和吸附分别进行单因素与正交实验结合的实验方案,并测定固定化酶的酶活力.结果:确定最佳交联条件:pH 5.5,温度35℃,交联剂质量分数0.5％,交联时间2h;最佳吸附条件:温度40℃,载体质量1.5g,吸附时间5h.在此工艺条件下,所制备的固定化脂肪酶活力为1.89 μkat,酶活力回收率72.89％.与游离的脂肪酶相比,所制备的固定化脂肪酶具有更好的温度、pH、储存及操作稳定性.结论:基于环氧交联剂新戊二醇二缩水甘油醚和硅藻土载体,进行先交联后吸附固定化海洋脂肪酶的技术具有良好的工业应用前景.