目的:获得我国隐匿性乙型肝炎病毒感染（occult HBV infection，OBI）人群中乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）基本核心启动子区（basic core promoter，BCP）、前C区和C区序列特征，为进一步阐明该区域与OBI的关系奠定基础。方法:收集2016—2018年全国18个省、自治区和直辖市的43家血站实验室，经日常检测后HBV DNA阳性的血浆样本。经实验室确认后HBsAg阳性样本和OBI样本各入组不少于200例，针对HBV BCP/前C区、C区和S区进行半巢式或巢式PCR和Sanger测序及序列分析。结果:完成测序417例样本，其中HBsAg阳性样本216例和OBI阳性201例，均为基因型B和C。HBsAg阳性组该区域的突变频率明显高于OBI组。在B基因型中仅发现1个OBI高频突变A1896G，在C基因型中发现T1762A/A1764G、T1803A/G、A1986G、T1866A（D22E）等OBI高频突变。在C基因型中发现的前C区ε-反式作用元件区域（1 847-1 907 nt）突变G1888T可能会改变前基因组RNA的茎环结构，从而影响其的转录。此外，还在OBI组首次发现了BCP区1 756-1 775 nt缺失突变，可能会直接影响HBsAg和HBeAg的表达，从而导致OBI的发生。结论:本研究深入分析了我国OBI献血者中BCP区、前C区、C区的序列基本特征，发现HBsAg阳性组该区域突变频率显著高于OBI组，TA缺失突变和G1888T可能会导致OBI的发生。

目的:分析儿童感染乙型肝炎病毒（HBV）基本核心启动子和前C（BCP/PC）区在不同基因型样本中的突变特征及其临床意义。方法:收集2011年至2018年期间就诊的294例儿童和92例成人慢性HBV感染患者，PCR扩增HBV BCP/PC区并直接测序，比对分析该区段基因突变情况。两样本均数比较采用 t检验，非参数资料的比较采用Wilcoxon-Mann-Whitney检验，两组资料率的比较采用χ 2检验或Fisher精确检验。 结果:儿童和成人患者均以B基因型为主，分别占76.9%、71.7%，C基因型分别占23.1%、28.3%。在儿童组，nt 1679、1721、1753、1757、1758、1762、1764、1775、1856及1858十个核苷酸位点在C基因型样本中的突变率显著高于B基因型样本，如G1721A、C1856T和T1858C突变在C基因型样本中的突变率分别为30.9%、16.2%和30.9%，而在B基因型样本中的突变率则分别为0.4%、0、0， P < 0.001。在成人组，只有nt 1679、1758、1775三个位点在C基因型样本中的突变率显著高于B基因型样本。这些位点多以联合突变的模式被检出，如T1858C突变共检出21例，其中20例为G1721A/A1775G/T1858C三联突变，10例为G1721A/A1775G/C1856T/T1858C四联突变，且这些联合突变模式仅在儿童C基因型样本中被检出，在儿童B基因型及成人样本中均无检出。进一步分析发现，G1721A/A1775G/T1858C三联突变组患者年龄明显低于无突变组患儿[（4.58±2.53）岁对比（6.53±4.02）岁， P = 0.012）]，血清HBV DNA滴度明显高于无突变组患儿[（7.57±2.03）log 10拷贝/ml对比（6.61±2.11）log 10拷贝/ml， P = 0.045）]。 结论:儿童感染HBV BCP/PC区在C基因型样本中的突变频率显著高于B基因型样本；与基因型相关的联合位点突变主要见于C基因型儿童样本，且与较低的患者年龄和较高的HBV DNA滴度相关。

中医的现代化以及标准化需要中西医结合的手段来实现.然而,中医研究强调整体观,目前的生物技术却无法有效的整合由分子生物学主导的基因组学、代谢组学以及转录组学等各种分子组学所产生的信息来完整的描述组织生理.与此同时,在单细胞层面,细胞已经完成对不同时空背景的复杂蛋白网络信息的整合,并将其表现在各种细胞行为上.在此,作者提出以细胞行为组学为主的策略并简短的介绍如何运用这种策略来进行针刺启动以及中药方剂的研究.病征和病因不一定有直接可见的连结.但是,病征必定起于病因.病征是身体部分组织产生不正常生理活动的结果,源于身体特定组织的组成细胞(生命的最基本单位)受到组织微环境不正常刺激所表现出来的异常表现.有时,组织内一种细胞的失序就能导致严重的疾病反应.譬如:胰脏内β细胞的损伤造成Ⅰ型糖尿病,或是骨骼肌细胞的凋亡产生肌肉萎缩症.同时,复杂的病理反应也常是部分组织受到特定的刺激后这些组织内多种细胞彼此相互作用的结果.譬如,在肿瘤发生的过程中,微环境刺激癌相关成纤维细胞的生成.而癌相关成纤维细胞又与免疫细胞相串扰,分泌各种细胞因子、生长因子等效应分子形成免疫抑制微环境[1].这样的环境培育了癌细胞免疫逃逸的能力.因此,组织微环境能够左右其内部的细胞行为而产生不同的机体生理与病理.造成不正常生理活动的原因(病因)常是基础医学关注的核心.了解病因后,我们才能试着遏制病因对组织内部细胞所产生的不正常影响,达到治病的目的.从这个角度来看,我们必须同时掌握一个组织内各种细胞的行为,才能以组织内细胞间的互动来描述组织生理与病理.在组织微环境中的各种生物因子(由机体内部各种细胞所产生的生物分子)以及环境因子(由机体外部吸收并出现在组织内的各种物质)都可能对其内的各种细胞产生影响.这些因子有大分子也有小分子,其中,大分子可能凭借自身的构型与相匹配的细胞表面受体产生交互作用,从而影响细胞中的生物信号通路,改变所属信号传输链所调控的细胞行为;另外,小分子还可能直接进入细胞,干扰细胞内蛋白的活性,据此改变细胞行为.因此,这些因子的出现决定了细胞行为.当一个外部刺激改变了组织微环境,组织内部细胞的行为也会随之改变.而这些细胞行为的变化本身又会成为组织微环境中的新刺激源.这些细胞行为的变化有物理性的、化学性的以及生物性的.物理性的包含细胞与细胞间的接触力、细胞对细胞间充质蛋白(细胞分泌到胞体外的蛋白)的粘附力、细胞散发出的热量等.化学性的包含细胞直接或是经由外泌体、微囊泡、以及凋亡小体等分泌出来的各种生物因子.生物性的则是生长、迁移、侵袭、凋亡等.这些变化在组织内成为新的刺激并以级联反应的方式在一段时间内持续改变组织内细胞的行为.组织内的各种细胞都适应了微环境的改变后,最终达成新的稳态,组织生理也就展现出新的样态(图1).如若外部刺激超过了常规水平而致使组织内部的细胞行为发生不正常的改变,组织可能就会处于病理发展的初始状态.以脑组织的生物力学为例,Segel等[2]发现脑组织硬度会随着衰老逐渐增加,进而影响中枢神经系统中少突胶质前体细胞的功能,而改变细胞外基质硬度可以逆转这一衰老表型.此外,脑组织硬度也介导诸如力传导、力敏蛋白的产生、以及细胞骨架重塑等细胞行为,从而诱发或加剧神经退行性疾病[3-4].而机体遭遇这些病理变化时的应变方式常是适应性的改变自身.例如在阿尔兹海默症中,小胶质细胞会感受到脑组织机械性质变化而定向迁移,施行包括对细胞外基质进行重塑、促进突触塑性、调控免疫响应等一系列复杂的细胞行为调适[5-7].由此可知,如若我们能够掌握组织微环境的改变对一个细胞行为的影响,并且在考虑它们的时空顺序后将这些改变叠加起来,我们就能了解组织生理与病理.而研究细胞微环境的改变对各种细胞行为影响的总成就是细胞行为组学[8].值得注意的是:细胞行为组学研究必须把对各种细胞行为的量化分析当成主要的手段,而传统分子生物学或是生物化学所衍生的各种分子组学则为背景知识.原因如下:医学研究的对象是生物体,不是物质.然而,基因或是蛋白都是物质,没有生命.所以它们不应是医学研究的首要对象.同时,从中医科学化的角度来看,中医的研究是整体性的,不能用以还原论为指导原则的分子生物学来主导,必须要从可以掌握整体组织生理活动的研究手段来实现.目前,针灸与方剂是中医施治的两种主要手段,所以在此就以如何运用细胞行为组学来研究针灸与方剂进行论述.在针灸研究方面:针灸经过两千多年的验证,其临床疗效有目共睹.而针刺作为最具影响力的中医外治疗法,被世界范围内认可.同时,近年来针刺的优势病种已经从疼痛类疾病逐渐扩展至消化系统疾病、泌尿系统疾病、妇科病、内分泌疾病、以及神经系统疾病等.从动物实验中表明针刺可以提高血管性痴呆大鼠脑内神经递质5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、去甲肾上腺素、多巴胺和乙酰胆碱的表达,改善血管性痴呆大鼠的学习和记忆能力,抑制神经凋亡[9].此外,针刺还可以调节脑内5-HT、脑源性神经营养因子等神经递质水平,抑制炎症,缓解焦虑、抑郁情绪[10].然而,以手针为例,手针仅通过一枚金属针作用于穴位,便可以调节脑内各种神经递质的作用,可是我们却无法了解手针针刺启动的明确机制.由于从进针、行针和留针,整个针刺过程中穴区所受到的刺激仅仅是由金属针施予的机械力,所以穴区细胞必定具备了由机械力向神经信号转化的能力[11].目前大部分的研究都指向穴区主要是由结缔组织构成的.结缔组织由独立的成纤维细胞、肥大细胞、树突状细胞、巨噬细胞、特洛细胞等及其分泌的胶原纤维蛋白、糖蛋白、蛋白多糖等外基质所组成.在针刺入穴位并施行提插、捻转等手法过程中,针体会与胶原纤维发生交联、并对其进行牵拉.然而胶原纤维自身无法产生生物反应,所以它的作用应仅是将机械力传递给粘附于胶原纤维上的细胞.如此,对于针刺启动的研究首要就在于判定哪种穴区细胞对机械力刺激敏感(力敏细胞),并且能粘附于胶原纤维之上.接着,必须探讨这些力敏细胞在感受到由胶原纤维传来的拉伸力后,能够分泌哪些由拉伸力引发的细胞因子(力敏因子).与此同时,这些力敏因子必须能够成为一种新的刺激源影响穴区周围的其他细胞行为,如肥大细胞脱颗粒、巨噬细胞极化等,并且引发针刺启动效应.如此,我们仅需要从单种细胞对其微环境的简单变化着手,并根据此细胞分泌的力敏因子研究这些因子对穴区非力敏细胞的效应,表明细胞间的级联反应,便可了解针刺启动过程中机械力信号向生物信号的转化的机制,这样的策略是细胞行为组学的完美体现(图2).在中药方剂研究方面:目前药理研究的手段是以分子生物学以及生物化学等技术为核心,这样的方法足以对于单靶点(仅对一种生物分子进行干预)分子药在细胞层面的药理进行研究.然而,中药方剂是以多种生物分子构成的多靶点(复方)药,以目前盛行的生物技术无法把它们的药理解释清楚.尽管近年来以分子组学分析为主的系统生物学逐渐成为中药方剂药理研究的主流,希冀从各种分子浓度的变化来描述受测中药对病理状态细胞干预的效果,但是这种方式产生的结果难以被定量评估,而且结论也仅局限于特定的细胞,难以扩展到组织层面.如前所述,在面对多病因的复杂类疾病时,现有的生命科学技术无法体现系统论的精神,遑论探讨复方中药与生命活动之间的联结讯息.另一方面,细胞最终展现的行为是组织微环境和细胞行为平衡的结果,在微环境中出现中药复方内千百种不同的单体时,不论这些单体如何以不同的时空关系对细胞内的蛋白网络进行干预,细胞最终会将其整合成明确的细胞行为.基于此,中药方剂的药理药效可以从细胞行为的角度有效整合现有的生物多组学体系,来解决系统生物学遭遇的难点.如此,我们可以绕过系统生物学在学术性面临的复杂预测手段,并了解复方分子对细胞的干预后细胞行为的改变结果.基于组织工程学及高通量的显微影像捕捉,细胞行为学运用精细的细胞行为表征快速实现时空连续的单细胞行为定量分析,通过包括卷积神经网络等深度机械学习算法对图像进行优化、切割、特征捕捉及分类.同时,对于方剂内不同药物组成的加减,我们也可以了解被加减药物对细胞行为的偏性,并了解中医用药的思想理论.通过这样的努力,中医药才能建立起一个以系统观为内涵的全新研究体系,以联结多种分子组学与细胞行为学的手段,架设链接微观到宏观的桥梁,辅助中药的创新以及现代化(图3).中医一直认为生命的本质不能仅从物质或能量层面去研究,必须兼顾物质、能量与信息.细胞行为组学基于生命的基本单位为研究核心,由细胞来体现物质与能量的变化.而蛋白网络中信息的传递则由细胞的动态行为来表征.细胞的蛋白网络变化才是生命的表现,而专注于特定蛋白或是特定基因在特殊微环境下的改变无法描述生命.生命科学讲求对生命的了解,中西医结合在于用现代生命科学技术去注解传统中医药的智慧,这两者都必须恪守不离开探索生命的本源.细胞行为组学立于生命科学之内,又能体现中西医结合的精神,是执行中医药现代化、科学化以及标准化进程的一种合适策略.

HBV核心启动子在病毒的复制和衣壳组装中起关键作用,深入了解其基本结构及功能、影响转录活性的因素及存在的突变类型,有利于进一步认识HBV复制及感染的进程并为慢性乙型肝炎的诊治提供新思路.在此基础上,通过检测HBV核心启动子区的突变位点也有助于预测HBV感染的结局以及治疗效果.该文就HBV核心启动子及其突变的相关研究进展作一综述.

目的 构建人细胞分裂周期25家族蛋白B(Cdc25B)基因启动子(promoter)荧光素酶报告基因载体pGL3-Cdc25B-promoter,并检测其转录活性.方法 应用欧洲启动子在线数据库(EPD)获得人Cdc25B基因5′端非编码区处包含转录起始位点在内的-2000～+100的DNA序列.以正常人全血基因组DNA为模板,利用PCR扩增该序列,并插入到pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体上.通过设计不同引物,进一步构建系列缺失体,共获得7个不同长度启动子序列的报告基因载体.将其与内参质粒pRL-TK瞬时共转染HeLa细胞,通过双荧光素酶报告基因活性测定实验检测不同缺失体的转录活性.利用定点突变及RNA干扰(RNAi)探究预测的转录因子对Cdc25B转录活性的影响.结果 构建的人Cdc25B基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-Cdc25B-promoter经酶切鉴定及测序结果比对完全正确,将其转染HeLa细胞后,检测到荧光素酶高表达(P<0.05).启动子系列缺失分析显示-160～-53片段包含基本核心启动子,与生物信息学的预测结果一致.定点突变及RNA干扰显示NF-YB转录因子对Cdc25B起正调控作用.结论 成功构建了7个具有转录活性的人Cdc25B启动子缺失片段,确定了NF-YB是Cdc25B转录的一个重要调控因子,为进一步将其用于抗肿瘤药物的筛选与评价奠定了基础.

为研究福建省慢性HBV感染者HBV基因多样性及变异规律,了解该人群HBV-DNA的病毒学特征.收集慢性HBV感染者血清标本,通过巢式PCR法扩增其HBV基因序列,比对NCBI数据库中标准基因型序列,分析HBV基因S区,基本核心启动子区(BCP)及前C区的序列变异情况,并对这些变异可能造成的病毒抗原表达,疫苗逃逸,患者病症改变等情况进行探讨.最终成功扩增82例HBV全长基因序列,其中B基因型56例,C基因型26例.基因组特定功能区序列分析发现慢性HBV感染者HBV基因在S区(23.2％)、BCP区(61.0％)和前C区(29.3％)均出现了不同程度的变异.其中主蛋白(HBsAg)主要抗原决定簇a决定簇45.8％位点出现了变异,这些变异位点中包括与肝炎重症化及免疫逃逸密切相关的位点(aa126、aa129、aa145等).位点G1896A(19.5％),G1764A(11.0％)和A1762T(9.8％)依然是BCP/前C区的主要突变位点.而位点A1752G(25.6％)高突变率的出现在BCP区应引起关注.此外位点G1764A(x2=5.742,P=0.030)、A1896G(x2=14.392,P=0.000)以及A1762T/G1764A(x2=7.289,P=0.012)的突变更容易发生在HBeAg阴性的样品中;而位点A1846T(x2=11.882,P=0.003)、A1762T(x2 =6.561,P=0.038)和A1896G(x2=6.958,P=0.030)的突变与HBV-DNA的病毒载量存在一定相关性.总之,福建省慢性HBV感染者在HBV不同基因功能区域均存在不同程度的变异,一些与HBeAg表达情况、HBV-DNA载量、疫苗免疫逃避及肝细胞癌发生具有相关联的变异位点已经出现,BCP区A1752G位点的高频率出现应值得关注,对于这些变异位点的患者应加强监测.

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)前核心区(PC区)G1896A和基本核心启动子区(BCP区)A1762T/G1764A突变与聚乙二醇化干扰素α-2b(Peg-IFNα-2b)治疗应答的关系及相关变异在治疗前后的变化.方法:69例HBeAg阳性慢性乙型肝炎(CHB)患者,接受48周Peg-IFNα-2b治疗并随访24周.PCR扩增每位患者第0周和第72周HBV PC和BCP区并测序分析突变情况,同时监测患者第0、4、8、12、24、36、48、60和72周HBsAg、HBeAg、丙氨酸转氨酶(ALT)和HBV的DNA水平.结果:共14例患者检测为野生型(20.29％),55例患者检测为突变型(79.71％).野生型较突变型HBeAg基线水平更高(P=0.024).患者基线和72周时野生型、PC突变型、BCP突变型和PC+BCP突变型所占构成比发生明显变化(P=0.004).野生型、PC突变型、BCP突变型和PC+BCP突变型患者在72周的HBeAg血清转换率和联合应答率差异均无统计学意义.结论:PC区和BCP区突变对HBeAg阳性B/C基因型CHB患者Peg-IFNα-2b治疗应答无明显影响,但治疗前后各突变所占构成比发生明显变化.

目的 探讨聚乙二醇干扰素α-2b (Peg-IFNα-2b)单药或联合阿德福韦(ADV)对前C区(PC区)/基本核心启动子区(BCP区)突变慢性乙型肝炎(CHB)患者疗效的差异.方法 89例乙肝e抗原(HBeAg)阳性初治CHB患者,随机接受48周Peg-IFNα-2b+ ADV联合治疗或Peg-IFNα-2b单药治疗,并随访24周.每位患者在治疗0、4、8、12、24、36、48、60、72周监测血清乙肝表面抗原(HBsAg)、HBeAg、乙肝病毒(HBV) DNA及谷丙转氨酶(ALT)水平.结果 89例患者中,73例(82％)为非野生型(Non-WT)患者,16例(18％)为野生型(WT)患者,基线时WT和Non-WT患者中的单药组和联合组分别在年龄、性别、ALT、HBV DNA、HBeAg、HBsAg、基因型构成比、PC/BCP区突变构成比等方面差异无统计学意义.治疗结束时(第48周),Non-WT患者中联合组和单药组HBeAg血清转换率和联合应答(HBeAg血清转换+HBV DNA＜2 000 IU/ml,并且ALT小于正常值上限)率方面差异无统计学意义.随访结束时(第72周),73例Non-WT患者中,联合组(n=40)和单药组(n=33) HBeAg血清转换率之比差异无统计学意义(P =0.519),但联合应答率差异之比有统计学意义(35％ vs 12％,P=0.028).结论 Peg-IFNα-2b联合ADV较Peg-IFNα-2b单药可明显提高PC/BCP区突变HBeAg阳性CHB患者治疗随访后的联合应答率.

目的 探讨慢性乙型肝炎(慢乙肝)患儿HBV前C(procore,PC)/基本核心启动子(basic core promoter,BCP)区的变异特点.方法 收集符合慢乙肝和肝硬化诊断标准的患儿血清166例.采用DNAout方法提取血清HBV DNA;巢式PCR方法扩增HBV PC/BCP区序列,PCR产物纯化后直接测序.分析HBVPC/BCP区相关位点变异情况.结果 166例患儿中,HBV B基因型的患儿占比20.83％,HBV C基因型的患儿占比79.17％.在感染HBV B基因型的患儿中,乙型肝炎(乙肝)肝硬化患儿与慢乙肝患儿的HBV DNA水平无明显差异,但前者G1899A位点突变率高于后者.在感染HBV C基因型的患儿中,与慢乙肝患儿相比,乙肝肝硬化患儿发生A1762T/G1764A、G1896A突变的比率明显升高且ALT水平较高.结论 HBV C基因型,ALT水平升高,发生A1762T/G1764A,G1896A位点变异的患儿,更容易发展为乙肝相关肝硬化.

通过对HBV基因的研究表明,HBeAg阴性慢性乙型肝炎(CHB)与HBV DNA中前C(PC)、基本核心启动子(BCP)区的基因突变相关,并指出PC/BCP区的突变不仅影响血清HBeAg的表达,也与机体内HBV DNA的低复制、疾病的进展和抗病毒治疗的应答反应密切相关,使得CHB的治疗变得更为复杂.就HBeAg阴性CHB目前治疗现状、HBV PC/BCP区基因的结构与变异、变异对HBeAg阴性CHB疾病进展以及对乙型肝炎抗病毒治疗的影响进行综述.