目的 探讨AMG510与放疗联合能否通过提高抗肿瘤免疫增加疗效.方法 体外使用细胞计数试剂盒8(CCK8)检测小鼠Lewis肺癌细胞系(LLC)对AMG510的敏感性,并对LLC进行RAS基因测序.使用C57BL/6小鼠构建移植瘤模型,随机分为4组[对照组、放疗(RT)组、AMG510组和AMG510+RT组],分别接受AMG510和(或)放疗的治疗方式,观察抑制肿瘤生长的情况.通过流式细胞仪及免疫组化的方法检测肿瘤浸润T淋巴细胞的情况.对治疗后的肿瘤进行基因表达测序,使用热图及信号通路富集等方法分析免疫相关基因表达变化.组间比较采用单因素方差分析或非参数检验中的中位数检验.结果 LLC细胞同时具有KRAS G12C和NRAS Q61H位点突变.CCK8结果显示,AMG510单药对LLC生长抑制至63％.体内实验结果显示,AMG510单药控制肿瘤生长作用有限,但联合放疗后肿瘤生长体积受到明显控制,优于任何单一治疗(均P＜0.05).流式细胞术结果显示,AMG510+RT组的肿瘤浸润CD3+T、CD4+T 和 CD8+T 细胞的比例为 3.29％(2.81％,6.44％)、1.04％(0.72％,2.43％)和 2.16％(0.93％,4.19％),相较于其他3组浸润增加,均P＜0.05;免疫组化结果显示趋势与流式细胞术一致.免疫组化结果显示,AMG510+RT组与对照组和RT组相比,能够增加干扰素(IFN)-γ+T细胞的浸润(均P=0.009),但调节性T细胞(Treg)及巨噬细胞浸润数量4组间差异无统计学意义,x2值分别为2.22和0.50,P值分别为0.528和0.918.基因测序分析显示,AMG510联合放疗对比对照组差异基因数据最多,包括399个上调和46个下调的基因,免疫相关基因表达上调.AMG510联合放疗及AMG510单药均能够增强趋化因子信号通路及T细胞受体信号通路.结论 AMG510与放疗联合能够显著抑制KRAS G12C突变肺癌生长,提高T细胞相关的肿瘤免疫,具有一定转化医学意义.

《中国多发性骨髓瘤诊治指南（2020年修订）》关于微小残留病（MRD）疗效标准部分仍参照2016年发表在《柳叶刀》上的国际骨髓瘤工作组（IMWG）多发性骨髓瘤（MM）疗效和MRD评估共识。大量研究证实MM治疗后的MRD转阴与患者的长期无进展生存（PFS）密切相关，而且越来越多的学者建议在临床试验中将MRD作为PFS的替代终点。因此，应用二代流式细胞仪、二代测序等方法检测MRD，对于MM患者预后预测、分层治疗等具有重要意义。由于新药治疗的出现以及各种检测方法自身存在的不足，MRD疗效评估尚存在一些问题，需要血液科医生高度关注。

细胞外囊泡（EV）是细胞分泌的极具异质性的纳米小囊泡，携带着来源于母细胞的各种生物活性分子，广泛分布于各种体液中，近年来在液体活检和疾病治疗中显示出巨大的应用前景。然而，传统流式细胞仪难以检测粒径小于300 nm的EV。基于瑞利散射和鞘流单分子荧光检测技术研发成功的纳米流式检测技术（nFCM）将EV的检测下限推进至40 nm，通过单粒子水平的多参数同时检测，可实现粒径、颗粒浓度和多种生化性状的同时分析，并可应用于EV临床诊疗研究中。

目的:探讨系统性免疫球蛋白轻链淀粉样变性（AL）初治患者的外周血免疫细胞表型特征及其与临床指标的相关性。方法:采用流式细胞仪多参数免疫荧光分析技术，对36例AL初诊患者和28名健康供者的外周血单个核细胞的表面抗原CD3、CD56、CD4、CD8、CD25、CD45RA、CD28、CD57及核内抗原FOXP3进行检测和比较。根据梅奥2012分期对AL患者进行分期，比较Ⅰ~Ⅱ、Ⅲ~Ⅳ期患者的免疫细胞表型差异。分析λ轻链型AL患者T细胞亚群比例与多项临床指标的相关性。结果:AL患者的外周血T（CD3 +CD56 -）和NKT（CD3 +CD56 +）细胞比例，T细胞中的CD4 +CD8 -、CD4 -CD8 +、Treg（CD4 +CD25 +FOXP3 +）细胞比例与健康供者相比差异无统计学意义（ P>0.05）。AL患者的CD4 -CD8 +细胞中，CD57 +细胞的比例较健康供者显著降低（ P<0.05），但CD45RA +和CD28 +细胞的比例在AL和健康供者间差异无统计学意义。Ⅰ~Ⅱ期和Ⅲ~Ⅳ期AL患者T细胞及其亚群的比例差异无统计学意义（ P>0.05）。在λ轻链型AL患者中，外周血CD4 -CD8 +细胞的比例与24 h尿蛋白和血肌酐呈正相关（ P<0.05），与eGFR呈负相关（ P<0.05），与其他临床指标无显著相关性。与此相反，CD4 +CD8 -细胞的比例与eGFR呈正相关，而与24 h尿蛋白和血肌酐呈负相关（ P<0.05）。 结论:AL患者外周血的T细胞亚群与健康供者相比差异无统计学意义，但CD8 + T细胞的比例与肾脏损伤程度呈正相关，提示CD8 + T细胞的比例在评估AL患者肾脏预后中具有一定的价值。

目的:探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的条件培养基对人永生化Müller细胞系MIO-M1细胞增生、黏附和分化的作用。方法:BMSCs传至第3代进行成骨、成软骨及成脂诱导培养基诱导分化，并分别使用茜素红、阿利辛蓝及油红O染色进行分化鉴定；采用流式细胞仪检测细胞中间充质干细胞标志物CD73、CD90和CD105以及造血干细胞标志物CD34、CD45和人类白细胞DR抗原(HLA-DR)表达。采用免疫荧光染色法检测MIO-M1细胞中Müller细胞标志物SOX9、谷氨酰胺合成酶(GS)、vimentin和胞内视黄醛结合蛋白(CRALBP)，视网膜干细胞标志物SOX2、nestin和CHX10，以及细胞增生标志物细胞周期蛋白D3(CCND3)的表达。将MIO-M1细胞分为标准培养基组、293T条件培养基组和BMSC条件培养基组，分别在标准培养基、293T培养上清液和BMSC培养上清液中培养。定量分析各组细胞面积、圆度、伸长系数、周长等形态参数；采用流式细胞仪检测细胞周期，采用成球实验和5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色法检测细胞增生情况。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各组培养上清液中血管细胞黏附分子1(VCAM-1)的表达；采用荧光定量PCR法检测各组细胞中VCAM-1 mRNA表达。采用免疫荧光染色法和荧光定量PCR法分别检测各组细胞诱导分化培养后视网膜神经元标志物蛋白激酶C(PKCα)、Rhodopsin、微管相关蛋白2(MAP2)和β-微管蛋白(Tuj1)的表达变化。结果:培养的BMSCs高表达CD73、CD90和CD105，低表达CD34、CD45和HLA-DR，并可成功诱导分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。MIO-M1细胞表达SOX9、GS、vimentin、CRALBP、SOX2、CHX10、nestin和CCND3。与标准培养基和293T条件培养基组比较，BMSC条件培养基组的MIO-M1细胞形态发生改变，形成细长的纺锤形或多极形态，且细胞面积减少，伸长系数增加，圆度降低，差异均有统计学意义( F＝6.973、12.370、6.311，均 P<0.01)；与标准培养基和293T条件培养基组比较，不同时间点BMSC条件培养基组MIO-M1细胞形成的神经球面积明显增大，差异均有统计学意义( F组别＝134.300， P＝<0.001； F时间＝82.910， P<0.001)；与标准培养基和293T条件培养基组比较，BMSC条件培养基组MIO-M1细胞的EdU阳性率和细胞增生指数均显著提高，差异均有统计学意义( F＝6.973、74.110，均 P<0.05)；与标准培养基和293T条件培养基组比较，BMSC条件培养基组的细胞上清液中VCAM-1蛋白质量浓度和细胞中的VCAM-1 mRNA相对表达量均显著升高，差异均有统计学意义( F＝13.720、7.896，均 P<0.05)；MIO-M1细胞在分化条件下，BMSC条件培养基组的MIO-M1细胞在mRNA水平的PKCα、Rhodopsin、Tuj1和MAP2相对表达量较标准培养基组和293T条件培养基组均明显升高，差异均有统计学意义( F＝14.490、5.424、14.330、7.405，均 P<0.05)。 结论:BMSC条件培养基可以改变Müller细胞的形态，并促进其增生、黏附和向视网膜神经元的分化。

目的:探索人工智能（AI）骨髓细胞识别技术在白血病微小残留病（MRD）检测上的诊断价值及问题。方法:收集陆军军医大学附属新桥医院血液病医学中心2020年11月1日至12月31日间经流式细胞术检查确认的白血病MRD患者65例，调取其骨髓瑞氏染色涂片，通过基于AI平台的分析系统对所有骨髓涂片进行无人工干预的全自动扫描及细胞分类。将AI细胞分类中原始细胞比例>3%者诊断为AI-MRD。按AI自动识别细胞数量，将病例分为识别细胞数少于500组（L500组）18例、识别细胞数500~1 900组（B1900组）35例、识别细胞数大于1 900组（M1900组）12例，组间病例无重合、遗漏。以多参数流式细胞仪（MFC）-MRD结果为标准绘制每组患者人工智能检测结果的受试者工作特征（ROC）曲线并计算各组曲线下面积（AUC）值和AI结果的敏感度、特异度、准确度。结果:按AI自动识别细胞数量分组后，L500组检测结果MFC-MRD+/AI-MRD+7例、MFC-MRD+/AI-MFC-2例、MFC-MRD-/AI-MRD+6例、MFC-MRD-/AI-MRD-3例；B1900组检测结果MFC-MRD+/AI-MRD+13例、MFC-MRD+/AI-MFC-6例、MFC-MRD-/AI-MRD+6例、MFC-MRD-/AI-MRD-10例；M1900组检测结果MFC-MRD+/AI-MRD+5例、MFC-MRD+/AI-MFC-0例、MFC-MRD-/AI-MRD+1例、MFC-MRD-/AI-MRD-6例。以MFC-MRD为确定标准，L500组、B1900组、M1900组AI-MRD检测的敏感度分别为53.8%、68.4%、83.3%，特异度分别为60.0%、62.5%、100%，准确度分别为55.6%、65.7%、91.7%，AUC值分别为0.568（ P=0.654）、0.678（ P=0.069）、1.000（ P<0.001）。 结论:初步探索了AI骨髓细胞识别在白血病MRD检测中的诊断价值及问题，证实当将AI细胞分类中原始细胞比例>3%设为AI-MRD阳性阈值时，随着AI识别细胞数量的增多，AI与MFC-MRD检测的一致性随之增高。

目的:探讨微小残留病（MRD）对移植前疾病状态≥完全缓解2（≥CR2）的急性淋巴细胞白血病（ALL）患者异基因造血干细胞移植（Allo-SCT）预后的影响。方法:回顾性分析2009年1月至2018年12月在北京大学人民医院接受Allo-SCT、移植前疾病状态≥CR2的ALL患者201例；植前1个月、移植后1、2、3、4、6、9、12个月，移植1年后每3个月用多参数流式细胞仪检测MRD；研究移植前MRD、移植后MRD和移植前后MRD动态变化对预后的影响。结果:201例患者中位年龄18（10.5，29.5）岁，其中男性126例、女性75例；3年累计复发率（CIR）、非复发相关死亡率（NRM）、无病生存（LFS）和总体生存（OS）分别为34%、16%、50%和56%。移植前MRD（pre-SCT MRD）阳性组患者的3年CIR高于阴性组（47%比26%， P=0.003），3年LFS（40%比55%， P=0.047）和OS（42%比60%， P=0.065）低于阴性组；移植后MRD（post-SCT MRD）阳性组患者的3年CIR高于阴性组（73%比22%， P<0.001），3年LFS（28%比56%， P=0.005）和OS（32%比60%， P=0.040）低于阴性组。多因素分析显示pre-SCT MRD阳性和post-SCT MRD阳性是移植后高CIR（ HR=1.823， P=0.018； HR=3.474， P<0.001）、低LFS（ HR=1.779， P=0.007； HR=2.185， P=0.001）和OS（ HR=1.609， P=0.034； HR=1.970， P=0.001）的独立影响因素。移植前后MRD均阴性组、移植后MRD无上升组和移植后MRD上升组患者的3年CIR分别是17%、42%和82%（ P<0.001），3年LFS为61%、44%和18%（ P<0.001）和OS为63%、47%和27%（ P<0.001）；移植前后MRD动态变化是CIR、LFS和OS的独立影响因素（ P值均<0.001）。移植前后MRD动态变化、post-SCT MRD和pre-SCT MRD预测移植后复发的C指数分别为0.669、0.629和0.587。 结论:对于Allo-SCT前疾病状态≥CR2的ALL患者而言，pre-SCT MRD阳性、post-SCT MRD阳性以及移植前后MRD动态变化都负面影响移植预后。

目的:观察外周血造血干细胞采集效果，并探讨其影响因素。方法:采用费森尤斯血细胞分离机、迈瑞血细胞分析仪及BD流式细胞仪，对采集过程的参数、血常规指标及产品的单个核细胞（MNC）和CD 34+计数进行检测。回顾性分析陆军军医大学西南医院2013年1月至2021年1月共72例行自体外周血造血干细胞移植患者的性别、年龄、血常规指标、采集循环量与采集物MNC和CD 34+计数相关性以及各因素对外周血干细胞采集效果的影响。 结果:不同年龄、性别和疾病类型的患者外周血干细胞采集效果差异无统计学意义（ P>0.05）。所有患者采集物的MNC与采集循环量（ r = 0.33， P<0.001）、动员后白细胞计数（ r = 0.41， P<0.001）呈正相关，CD 34+计数与动员后MNC计数（ r = 0.38， P<0.001）和收集白膜量（ r = 0.48， P<0.001）呈正相关。多元回归分析结果显示，动员后MNC计数[ P<0.001，95% CI 0.07（0.05 ~ 0.09）]、采集循环量[（ P<0.001，95% CI 0.00（0.00 ~ 0.00）]、采后总量[ P<0.001，95% CI 0.07（0.05 ~ 0.10）]是采集物MNC计数的影响因素。此外，动员后MNC计数[ P<0.001，95% CI 0.09（0.04 ~ 0.14）]、采集循环量[ P = 0.003，95% CI 0.00（0.00 ~ 0.00）]、采后总量[ P = 0.005，95% CI 0.08（0.03 ~ 0.14）]也是CD 34+计数的影响因素。 结论:外周血干细胞的采集效率个体差异大，动员后MNC计数越多，采集到的外周血干细胞量越多。要想获得高的采集效率，需要有针对性地调整好采集前外周血MNC等参数，并注意采集循环量、采后总量和收集白膜量。

目的 探究miR-424 靶向张力蛋白同源第10 号染色体缺失的磷酸酶基因(PTEN)调控白细胞介素(IL)-6/信号转导与转录因子(STAT)3 信号通路影响骨髓瘤(MM)细胞增殖和凋亡的机制.方法 靶基因预测、双荧光素酶报告实验验证miR-424 对PTEN的靶向调控作用;采用实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测骨髓瘤患者骨髓标本及骨髓瘤细胞株中miR-424、PTEN的表达,并分析miR-424 表达与患者临床病理参数的关系;采用脂质体瞬时转染法将mimic NC、miR-424 mimic、anti-miR-424 mimic、si-control、si-PTEN转染H929、U266 细胞并分为对照组、miR-NC组、miR-424 组、anti-miR-424 组、an-ti-miR-424+si-NC组和anti-miR-424+si-PTEN组;噻唑蓝(MTT)法及单克隆染色检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,Western印迹检测PTEN、IL-6、STAT3、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、原癌基因(c-Myc)水平.结果 双荧光素酶实验及Western印迹验证了miR-424 对PTEN的靶向调控作用.MM患者骨髓标本及MM细胞株中miR-424 水平明显高于正常骨髓标本及浆细胞,PTEN水平明显低于正常骨髓标本及浆细胞,且miR-424 水平与PTEN水平呈负相关,与ISS分期、危险分层、轻链类型呈正相关关系.与miR-NC组相比,miR-424 组细胞增殖能力、IL-6、STAT3、Bcl-2、c-Myc水平明显升高,凋亡率、PTEN、Bax水平明显降低;anti-miR-424 组细胞增殖能力、IL-6、STAT3、Bcl-2、c-Myc水平明显降低,凋亡率、PTEN、Bax水平明显升高(P<0.05).与anti-miR-424+si-NC组相比,anti-miR+424-si-PTEN组细胞增殖能力、IL-6、STAT3、Bcl-2、c-Myc水平明显升高,凋亡能力、PTEN、Bax水平明显降低(P<0.05).结论 MM细胞的增殖、凋亡受miR-424 及PTEN的双重调控,miR-424 可靶向PTEN调控IL-6/STAT3 信号通路影响MM细胞的增殖和凋亡.

目的 细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)称为细胞间"信使",通过传递物质和信息调控受体细胞的功能和表型,在生理状态维持及疾病进程中发挥重要作用.然而,亚微米直径、高异质性、低折射率等特性使EVs的分析鉴定严重受阻.本研究旨在探索一种准确、高效的EVs流式检测方案,为EVs的功能研究提供技术支撑.方法 首先采用差速离心法分离获得EVs,用已知直径的聚苯乙烯微球作为标尺,对流式细胞仪检测EVs的各项参数进行调试和优化以达到最佳信噪比;梯度稀释EVs样本,优化其上样浓度以降低群检测效应(swarming effect),在此基础上进一步用PKH26 和CFSE两种荧光染料对EVs脂膜和蛋白进行双荧光标记,从而实现对EVs物理和生化特性的多参数分析,最后通过特异性抗体标记、电镜观察、纳米颗粒跟踪分析对EVs样本进行验证分析.结果 参数优化后的流式细胞仪在散色光通道能将80 nm的微球信号与仪器背景噪音信号清楚分开;通过对样本的梯度稀释建立的浓度与稀释倍数之间的标准工作曲线的相关系数达0.99以上,说明仪器可以对EVs进行定量分析;荧光染色显示EVs呈CFSE及PKH26双阳性,占比约5.46%,与抗体标记的结果相近;电镜和纳米颗粒跟踪分析验证其粒径及群体分布与流式结果一致.结论 联合散射光与脂膜荧光染料标记是一种经济、高效的EVs流式检测方案,有利于EVs流式分析的标准化.