目的:采用肺炎克雷伯菌耐药靶标KPC-2为抗原制备重组蛋白疫苗，在小鼠肺炎模型中评价疫苗的免疫原性、保护效果和保护机制。方法:利用大肠埃希菌原核表达系统表达肺炎克雷伯菌KPC-2蛋白，经GST亲和层析对目的蛋白进行纯化；采用KPC-2蛋白制备疫苗，经皮下注射免疫新西兰兔，心脏采血分离血清，用Protein G亲和层析纯化多克隆抗体，同时运用调理吞噬杀菌试验检测抗体的体外杀菌活性。采用KPC-2疫苗免疫雌性BALB/c小鼠3次，间接ELISA检测血清中特异性IgG抗体滴度。末次免疫后7 d，通过气管插管构建小鼠肺炎克雷伯菌肺部感染模型，感染1 h后尾静脉给予0.1 mg美罗培南治疗，通过比较免疫组与佐剂组的生存率、细菌定植量和组织病理学差异，以及给药组与生理盐水组生存率的差异评价疫苗的保护效果。采用KPC-2多克隆抗体被动免疫评价抗体的保护效果。结果:KPC-2免疫组小鼠血清特异性IgG水平显著高于对照组( t＝4.325, P<0.05)，免疫组生存率显著高于对照组[70% (7/10) vs 10% (1/10)， P<0.05]；免疫组小鼠肺组织炎性程度及细菌定植量显著低于对照组( t＝3.127, P<0.05)；疫苗主动免疫与被动免疫均具有良好的保护效果，且对抗生素治疗有明显的增效性；KPC-2多克隆抗体在体外表现出明显的吞噬杀菌活性( t＝5.427, P<0.05)。 结论:KPC-2疫苗具有良好的免疫原性和保护效果，体液免疫应答在其保护中发挥了重要作用，证明采用耐药靶标作为抗原制备疫苗具有可行性。

目的 监测老年人接种23价肺炎球菌多糖疫苗(pneumococcal capsular polysaccharide vaccine-23,PPV-23)后特异性功能性抗体的水平.方法 选择沪籍60岁以上健康及结核病痊愈老年人接种PPV-23疫苗,采用肺炎链球菌荚膜多糖多型调理吞噬杀菌试验(multi-specificity opsonophagocyitosis killing assay,MOPA)分别对接种前、接种后1个月、6个月的13种血清型(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F)肺炎球菌的抗体水平进行检测,并对两组人群接种后1个月、6个月的13种血清型OPA抗体水平(GMT)及抗体增长率进行统计学分析.结果 大部分老年人接种PPV-23后1个月、6个月13种血清型的OPA抗体GMT均显著高于接种前(P＜0.05),接种后6个月结核病痊愈者的1、3型与接种前差异无统计学意义(P＞0.05),且接种后1个月与6个月的6A、6B、7F、18C、19F、23F型抗体差异无统计学意义(P＞0.05).接种后1个月13种血清型OPA抗体水平≥2倍增长率均≥60％(除结核病痊愈者1型为37.5％外),且两组人群差异无统计学意义(P＞0.05);除结核病痊愈者1、3型外,两组人群各型别OPA抗体水平≥4倍增长率差异无统计学意义(P＞0.05).接种后6个月13种血清型OPA抗体水平≥2倍增长率在45％以上,且除1型外,两组人群间差异无统计学意义(P＞0.05);除1型、18C型外,两组人群OPA抗体水平≥4倍增长率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 健康和结核病痊愈老年人接种PPV-23后可产生针对13种血清型的特异性功能性抗体,且可维持6个月,但结核病痊愈者接种PPV-23后1、3型的OPA抗体水平和持久性明显低于健康老年人.

目的 通过对2010-2016年间09CS针对13个型别的肺炎链球菌荚膜多糖特异性抗体滴度的分析,探讨调理吞噬杀菌试验(multiplexed opsonophagocytic killing assays,MOPA)的长期稳定性.方法 统计2010-2016年检测人肺炎链球菌质量控制血清(质控血清)09CS中针对1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F共13个血清型的OPKA滴度,分别计算2010、2011、2012、2013、2014-2016年09CS针对各个型别的OPKA滴度的GMT值及其95％可置信区间;统计09CS针对13个血清型的OPKA滴度在质量控制范围之内的比率;计算2010-2016年09CS针对13个血清型各型别的OPKA滴度CV值.结果 从OPKA滴度来看,2010年普遍较低,而2011年、2012年、2013年、2014-2016年这几年间的09CS针对13个血清型的滴度结果稳定.2011-2016年期间检测结果在质控血清滴度范围的比率:2010年最低值是4％,均值为30％;2011年最低值是65％,均值为80％;2012年最低值是73％,均值为85％;而2013年最低值为77％,均值为94％;2014-2016年最低值为71％,均值为90％.2010-2016年09CS针对13个血清型的OPKA滴度各型别CV:各年份的平均值分别为:125％、64％、47％、41％和39％.结论 充分证明了从2011年起本实验室建立的MOPA稳定性良好.

目的 建立重组金黄色葡萄球菌疫苗免疫血清中功能性抗体检测方法.方法 在参考美国阿拉巴马大学的多重调理吞噬实验(UAB-MOPA)方法的基础上,构建并鉴定HL-60效应细胞库及金黄色葡萄球菌工作种子批,完成补体浓度、调理和吞噬孵育时间及血清预稀释倍数等关键实验参数的优选.在此基础上对5种不同来源金黄色葡萄球菌进行调理吞噬杀菌(OPK)活性的检测.结果 HL-60细胞经0.8％ DMF诱导分化4d后,CD35表达量为87.1％,CD71表达量为2.82％,活细胞比例为75.7％;靶细菌工作种子批冻存复活率＞90％,工作稀释度＞1 000;体系中补体终浓度确定为6％;选择30 min、60 min作为调理和吞噬孵育时间;血清预稀释倍数为2倍;疫苗免疫血清对5种不同来源的金黄色葡萄球菌均表现出良好的OPK活性及标准的“S”型杀菌曲线.结论 本研究优化建立的OPK检测方法,可有效评价重组金黄色葡萄球菌疫苗的体外功能性抗体水平,为疫苗临床试验样本检测及免疫有效性替代终点的确立提供了重要的技术支撑.

目的 血清型6C和6D是近些年新发现的肺炎链球菌血清型.本研究的目的是考察肺炎链球菌13价结合疫苗PCV13(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F)里的6A和6B能否诱导对新血清型6C和6D的交叉保护抗体,以及它们对交叉保护抗体的贡献.方法 PCV13、6A和6B荚膜多糖分别与CRM197的结合物PCV6A和PCV6B分别于第0天、第14天和第28天以等剂量肌肉注射免疫新西兰兔.免疫前和第35天采血分离血清.采用世界卫生组织( WHO)推荐的定量酶联免疫吸附试验(ELISA)检测兔血清中针对6A、6B、6C和6D荚膜多糖的抗体浓度,并采用WHO肺炎链球菌血清学参考实验室的调理吞噬试验(OPA)检测兔血清抗体针对6A、6B、6C和6D的杀菌功能.结果 PCV13能够诱导兔产生针对6A和6B荚膜多糖的抗体,该抗体不仅能够与6C和6D荚膜多糖产生交叉反应,而且能够识别靶细菌6A、6B、6C和6D并激活补体,在激活补体的调理下,靶细菌被分化的HL60细胞吞噬,它们对靶细菌6A、6B、6C的杀菌滴度大致相当,但略高于对6D. PCV6A能够诱导兔产生针对6A荚膜多糖的抗体,该抗体能够与6B、6C和6D荚膜多糖产生交叉反应,它对靶细菌6A、6B和6C的调理吞噬滴度高于对6D. PCV6B能够诱导兔产生针对6B荚膜多糖的抗体,该抗体能够与6A、6C和6D荚膜多糖产生交叉反应,它对靶细菌6A、6B和6C的调理吞噬滴度高于对6D. PCV13、PCV6A和PCV6B免疫后针对6A、6B、6C和6D的荚膜多糖特异性抗体浓度和杀菌滴度均较免疫前有显著性升高(P<0. 01).结论PCV13能够诱导兔产生针对6A和6B的抗体,它们不仅能够与6C和6D的荚膜多糖产生交叉反应,而且能够交叉保护6C和6D. PCV13中的6A和6B均对产生6C和6D的交叉保护抗体有贡献,其中对6C的贡献多于对6D.

目的 建立肺炎球菌多重调理吞噬杀菌实验,并在此基础上评价肺炎球菌疫苗免疫后效果.方法 参照美国阿拉巴马大学多重调理吞噬杀菌实验方法(MOPA),构建7价肺炎球菌结合疫苗血清型的肺炎球菌的工作菌种库和HL-60细胞库,测定工作菌种库抗生素耐药性及稀释度,HL-60分化5～6d后的表面标志表达量及活性,同时测定标准血清007SP和参考血清09CS的调理杀菌值;在方法建立的基础上,对疫苗免前免后获得的6对血清样本的功能性抗体进行检测.结果 工作菌种稀释度均＞ 300倍;HL-60分化5～6d的表面标志表达量CD11b＞ 80％,CD35＞ 70％,CD71＜15％,活细胞比例＞70％,凋亡细胞比例＜21％;补体的非特异杀伤均＜30％.标准血清007SP和参考血清09CS的调理杀菌值稳定在质控范围内;疫苗接种后,血清样本的杀菌曲线为S型曲线,并且调理杀菌值保持在较高水平.结论 成功建立MOPA实验方法,为肺炎球菌疫苗免疫后的效果评价提供了方法依据.