为了考察无氧运动训练和停训对两栖动物运动能力及其能量代谢特征的影响,将实验对象大鲵(Andrias davidianus)幼体分为6个组:训练对照组(TC)、2天1次训练组(TOT)、1天1次训练组(TOO)、停训对照组(DC)、2天1次停训组(DOT)、1天1次停训组(DOO).在20℃下,训练组(TOT和TOO)进行持续3周2天1次或1天1次力竭追赶训练,停训组(DOT和DOO)进行持续3周2天1次或1天1次力竭追赶训练后停训1周,随后测定相对感应流速、相对暴发游泳速度及力竭运动后过量耗氧.研究发现:所有组的相对感应流速之间都没有显著差异.TOO组相对暴发游泳速度显著高于TC组和TOT组,DOO组相对暴发游泳速度显著低于TOO组(P＜0.05).所有组的运动前代谢率和峰值时间之间都无显著差异.TOO组运动后代谢峰值、代谢率增量、运动后恢复时间和过量耗氧都显著高于TC组和TOT组,DOO组运动后代谢峰值、代谢率增量、运动后恢复时间和过量耗氧都显著低于TOO组(P＜0.05).综上所述:(1)无氧运动训练显著提高了大鲵幼体的无氧运动能力,这可能与其无氧代谢功能的增强有关;(2)无氧运动训练的效果与其训练强度密切相关,并且维持时间较短.

中国大鲵(Andrias davidianus)是世界上最大的两栖动物,曾在中国广泛分布.前期的3项分子遗传学研究表明:黄山的中国大鲵种群存在独特的遗传分化,是一个未被描述的物种.这3项研究中的分子数据均基于本文通讯作者1995年之前采自中国安徽省黄山市祁门县的原生大鲵标本.本文基于形态学比较,将1995年以前本文通讯作者在祁门县采集的11个大鲵标本描述为大鲵属一新种:祁门大鲵(Andrias cheni sp.nov.).我们测量了11个标本的25个形态特征,并与大鲵属的其他物种进行比较.祁门大鲵与大鲵属其他物种可通过以下特征进行区分:(1)头躯扁平,头长略大于头宽,头宽/头长(HW/HL)比为0.80～0.98;(2)头部和下颌相对光滑,有不规则排列的小结节;(3)颈部侧褶与体褶不连续:(4)第三指比第一指长,指式Ⅰ＜Ⅳ＜Ⅲ＜Ⅱ;(5)四肢粗而短,后肢比前肢长,前肢长/后肢长(FLL/PLL)比为0.78～0.96;(6)尾部肌肉发达,基部粗大,后部和上部逐渐变平,尾长约为总长度的1/3.经形态比较,本研究将祁门大鲵描述为新种,大鲵属物种增加到5个.本文提供了相对完备的形态数据,可为后续大鲵野生谱系的资源保护、人工种群遗传管理和增殖放流等提供参考.

为了考察摄食水平对两栖动物运动能力及其能量代谢特征的影响,选取大鲵(Andrias davidianus)幼体为实验对象,分别测定其在不同摄食水平(0、1％、4％和10％体重)下的感应流速(Induced velocity)、暴发游泳速度(Burst swimming speed)和力竭运动后过量耗氧(Excess post-exercise oxygen consumption,EPOC).研究发现:在不同摄食水平下,大鲵幼体绝对和相对感应流速(分别为20.78、21.52、23.67、21.79cm/s和2.4、2.49、2.77、2.56 bl/s)及绝对和相对暴发游泳速度(分别为32.65、32.92、35.42、33.02 cm/s和3.80、3.81、4.15、3.85 bl/s)没有显著性差异;随着摄食水平的增加,运动前代谢率[分别为66.88、82.51、95.57和106.32 mg O2/(kg·h)]和运动后代谢峰值[分别为148.21、155.08、166.93和167.63 mg O2/(kg·h)]逐步增加,4％和10％摄食水平组显著高于对照组(P＜0.05);随着摄食水平的增加,代谢率增量[分别为81.33、72.57、71.36和61.31 mg O2/(kg·h)]、峰值比率(分别为2.26、1.89、1.76和1.58)、运动后恢复时间(分别为55.00min、49.60min、38.80min和32.10min)和过量耗氧(分别为27.48、23.68、21.42和15.36 mg O2/kg)逐步降低,4％和10％摄食水平组显著低于对照组(P＜0.05).综上所述:大鲵幼体游泳能力相对较小且不受摄食的影响,在其野外栖息地保护和增殖放流生境流速选择等实践中应充分考虑.摄食后大鲵幼体游泳能力的维持、有氧代谢能力的增加和力竭运动后恢复时间的缩短可能有利于大鲵幼体的捕食和避敌活动,有助于适应复杂的溪流生境,进而提高其生存适合度.

Sox2是Sox转录因子超家族B1亚族成员之一,对胚胎发育和神经细胞的维持有重要作用.本研究以中国大鲵(Andrias davidianus)性腺组织为材料,通过RT-PCR和RACE方法成功克隆到中国大鲵Sox2基因全长2 233 bp cDNA.系统进化树分析表明,中国大鲵与红腹蝾螈、火焰蝾螈及六角恐龙聚成一支,这与其在两栖类中分化较早相一致.实时荧光定量PCR检测Sox2基因在中国大鲵组织表达结果显示,其在性腺中的表达量最高,肾脏中次之,在肠道中几乎不表达,表明Sox2基因可能在大鲵性腺发育和生长发育过程中发挥了重要作用.这为今后进一步研究Sox2基因在大鲵性别分化中的功能提供了参考.

实验构建了大鲵短型肽聚糖识别蛋白PGRP-S的真核表达质粒, 并对其功能进行了初步的研究.序列分析显示, 所克隆的大鲵PGRP-S的N端不含有信号肽; 其编码的氨基酸序列具有2个相距较近的半胱氨酸残基以及2个Zn2+结合位点.Western-blotting检测结果显示大鲵PGRP-S既可分泌到胞外, 也可滞留在胞内.体外抗菌实验的结果表明,过表达大鲵PGRP-S能显著抑制迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)在HEK293T细胞内和胞外培养基中的增殖.此外, 过表达大鲵PGRP-S能诱导NF-κB启动子的活性; 能结合Lys-type和Dap-type的肽聚糖但不能降解它们.研究结果表明大鲵PGRP-S在功能上类似于哺乳动物而有别于硬骨鱼类短型的肽聚糖识别蛋白.

[背景]腺苷三磷酸酶(ATPase,ATP酶)是控制DNA复制起始及宿主对病原微生物的应答开关.近期关于水生动物虹彩病毒基因组学的研究表明,它们共享编码ATPase的基因.[目的]大鲵蛙病毒(Andrias davidianus ranavirus,ADRV)属于虹彩病毒科,是世界现存最大两栖动物——中国大鲵的致死性病毒病原体.为了鉴定病毒基因及其表达产物对病毒复制和宿主细胞的影响,对ADRV编码ATPase的基因ADRV-96L进行了克隆、表达及功能分析,阐明这个虹彩病毒核心基因的功能.[方法]采用PredicProtein软件分析序列,构建重组原核表达质粒pET32a/His ADRV-96L,经IPTG (Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)诱导在大肠杆菌DE3中表达蛋白,用镍树脂纯化和咪唑液洗脱.钼蓝分光光度法检测产生的无机磷(Pi)以确定纯化ADRV-96L的ATPase活性.建立表达蛋白的稳定转染细胞系并进行鉴定,再分别通过绘制病毒的一步生长曲线和评估转染细胞的生长速率来测定该蛋白对病毒复制及细胞生长的影响.[结果]多重序列比对显示ADRV-96L存在含Walker A和Walker B基序的AAA-ATPase (ATPases associated with a variety of cellular activities,与各种细胞活性相关的ATPase)结构域(20-159位氨基酸)及两个高度保守的精氨酸.重组原核质粒表达了含ADRV-96L的52 kD融合蛋白,该蛋白质具有ATPase活性(酶的比活性平均为4.68 U/mg).结果未检出ADRV-96L对病毒的复制影响,但显示该蛋白可促细胞生长.[结论]大鲵蛙病毒96L基因(ADRV-96L)编码一个促细胞增殖和生长的ATPase.

为发掘大鲵的功能基因, 该研究以大鲵组织作为研究对象, 利用RNA-seq技术对大鲵进行转录本测序和数据分析, 经拼接组装共获得132 912条Unigenes, 序列平均长度690 bp, N50为1 263 bp.另外从长度分布、GC含量与表达水平等方面对Unigenes进行评估, 数据显示测序质量好, 可信度高.此外, 本研究也预测出132 416个能编码蛋白的Unigenes.使用9大数据库CDD、KOG、NR、NT、PFAM、Swiss-Prot、Tr EMBL、GO和KEGG注释大鲵转录组Unigenes, 分别对应有24 049、18 406、36 711、15 858、20 500、27 515、36 705、28 879和10 958条Unigenes获得注释.其中, 6 323条Unigenes在以上所有数据库中同时注释成功, 39 672条Unigenes至少被一个数据库注释.KEGG分析结果显示:获得注释的10 958条Unigenes被划分到343个代谢通路中, 参与信号转导通路的Unigenes数最多, 共有2 644条 (24.12％);其次是免疫系统通路的Unigenes有2 450条 (15.29％).最后本研究还检测到了29 790个SSR位点.通过对大鲵转录组测序, 获得了大量的转录组信息, 有助于进一步研究大鲵功能基因克隆、基因组学、遗传多样性分析和分子标记开发等.

刺鼠信号蛋白(Agouti)是哺乳动物和鸟类黑色素合成过程中的重要调控因子,影响动物的体色(毛色).为研究Agouti在两栖动物体色形成过程中的作用,本研究利用PCR技术扩增得到大鲵Andrias davidianus的Agouti基因部分cDNA序列并进行了相关的生物信息学分析,进一步使用实时荧光定量PCR检测了大鲵Agouti基因在皮肤、肝脏等10个组织和器官中的表达情况,并检测了4种不同体色大鲵皮肤组织中Agouti基因的表达量.同时采用直接测序法,比较了不同体色大鲵Agouti基因编码区的序列差异.结果显示,大鲵Agouti基因cDNA序列长1 068 bp,开放阅读框399 bp,编码132个氨基酸残基.蛋白质同源性分析表明,大鲵Agouti蛋白具有与其他物种一致的保守Agouti结构域,其蛋白质序列与两栖爬行类序列相似性较高,与哺乳动物和鸟类相似性较低.系统进化分析显示,大鲵Agouti基因与高山倭蛙Nanorana parkeri、美国短吻鳄Alligator mississippiensis、中华鳖Pelodiscus sinensis等物种的亲缘关系较近.实时荧光定量PCR分析表明,Agouti基因mRNA在大鲵不同组织中均有表达,皮肤中的表达量最高.在4种不同体色大鲵皮肤组织中,黄色皮肤中的Agouti基因表达量高于其他体色.不同体色大鲵Agouti基因编码区序列一致.大鲵Agouti基因独特的序列特征及其表达的组织特异性暗示了其在两栖动物体色形成过程中可能具有与其他物种不同的调控机制.这些结果为进一步研究Agouti在大鲵体色形成过程中的作用提供了基础资料.

通过对秦岭山区中国大鲵(Andrias davidianus)栖息地生境因子调查、统计,利用R语言分析了各因子与大鲵生境选择的相关性,得出研究结果:秦岭山区影响大鲵生存的主要因子为栖息地类型(相关系数r=0.98),其次是水温(相关系数r=-0.8)、河岸坡度(r=-0.6)和pH(r=-0.6);浊度(相关系数r=0.5)、电导率(r=0.49)、DO(r=0.4)、人为干扰(r=0.35)和海拔(r=0.31)对大鲵分布影响不大.研究结果为探讨中国大鲵对野生环境的适应性选择提供了参考.

为优化大鲵皮肤黑色素的提取工艺条件,探讨大鲵皮肤黑色素组成成分及体外抗氧化活性,采用酶法和碱溶酸沉法提取大鲵皮肤黑色素,以氢氧化钠浓度、液料比、提取温度为影响色素提取率因素,优化黑色素提取工艺条件,用紫外-可见光谱仪、红外光谱仪和超高效液相质谱仪测定黑色素的光谱特性,测定其抗氧化性.结果 表明:大鲵皮肤黑色素最佳提取工艺条件为氢氧化钠浓度1.5 mol/L、液料比1∶15、提取温度45℃,黑色素提取率达0.65％.大鲵皮肤黑色素的紫外最大吸收波长为214 nm,由真黑色素和脱黑色素两种色素组成,其对超氧阴离子自由基的清除率为30.51％,对羟基自由基的清除率为54.17％.大鲵皮肤黑色素具有一定的体外抗氧化能力.