[背景]帕马霉素属于大环内酯类抗生素,具有较好的抗感染活性.该类化合物独特的化学结构和显著的生理活性受到了许多研究者的关注.同时,本实验室在林可链霉菌NRRL2936的全基因组序列中发现了帕马霉素的生物合成基因簇.[目的]尽管其生物合成途径已经得到了解析,但其生物合成基因簇中的2个调控基因功能尚不清楚.本研究从林可链霉菌NRRL2936的基因组文库中克隆了含有帕马霉素生物合成完整基因簇的质粒pJQK450,开展了质粒pJQK450在链霉菌中的异源表达,实现了帕马霉素的异源合成,并初步确定该生物合成基因簇中两个调控基因的功能.[方法]利用聚合酶链式反应递缩基因组文库筛选的方法,从林可链霉菌(Streptomyces lincolnensis) NRRL 2936基因组文库中筛选到了含有帕马霉素生物合成完整基因簇的Fosmid质粒pJQK450.然后,将该质粒转化到E.coli ET12567/pUZ8002中,利用大肠杆菌-链霉菌双亲接合转移的方法将pJQK450转入异源宿主中.对获得的异源表达菌株进行发酵产物的制备,采用耻垢分枝杆菌mc2155作为指示菌株进行帕马霉素生物活性测试,并结合LC-MS的分析确定帕马霉素的产生情况.最后,通过基因失活与回补的方法,考察帕马霉素生物合成基因簇中调控蛋白ParmR1和PamR2对帕马霉素生物合成的影响.[结果]帕马霉素生物合成基因簇在天蓝色链霉菌Ml154中实现了表达,证明PamR1和PamR2负调控了帕马霉素生物合成的过程.[结论]帕马霉素完整基因簇的成功异源表达,一方面便于其生物合成途径的遗传改造,为帕马霉素的生物合成及优产改造研究奠定了基础;另外,调控基因功能的研究为帕马霉素的产量优化提供了改造的目标.

Sansanmycins (SSs)是一类由Streptomyces sp. SS产生的尿苷肽类抗生素,具有抗结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌活性.该类化合物主要是由4',5'-烯胺-3'-脱氧尿苷通过肽键与假四肽肽链中的N-甲基-2,3-二氨基丁酰基(DABA)相连.为了研究相关基因的功能,进一步利用合成生物学的手段获得SSs的新结构衍生物,本实验克隆了完整的SS生物合成基因簇,并将其在天蓝色链霉菌M1146、M1152和M1154中异源表达.借助于HPLC和LC-HRMS/MS等对重组菌株的发酵液进行分析,结果表明三株异源表达菌株均能产生SS-A,而且M1154异源表达菌株的SS-A产量与未退化的野生型菌株相当.同时从M1154异源表达菌株发酵液中发现了一个可能为新结构的SS类似物SS-1154.

目的:将来源于龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)M527的otrA基因在天蓝色链霉菌M145中异源表达,通过考察宿主菌对土霉素以及氨基糖苷类抗生素的抗性、放线紫红素的合成、菌株形态等方面的变化鉴定otrA基因的功能.创新点:S.rimosus中的otrA基因与转录延伸因子EF-G具有很高的同源性,被认为是土霉素的抗性基因之一,但其具体的生物学功能目前尚未有研究报道.本文首次实现otrA基因在天蓝色链霉菌M145中的异源表达,不仅提高了宿主对土霉素以及氨基糖苷类抗生素的抗性,还促进了菌株产孢和放线紫红素的合成,从而初步证实了OTRA生物学功能.方法:克隆来源于S.rimosus M527的otrA基因,将其置于链霉菌整合型载体pIB139强启动子PermE*的下游,构建重组质粒pIB139-otrA;通过接合转移将其转入天蓝色链霉菌M145获得重组菌M145-OA,实现otrA基因在天蓝色链霉菌M145中的异源表达;通过扫描电镜观察菌株的形态变化;通过含有不同浓度的不同抗生素的抗性平板筛选测试菌株的抗性水平变化;通过5-L发酵罐发酵实验考察次级代谢产物放线紫红素的合成能力变化;通过荧光定量PCR考察放线紫红素合成途径中的调控基因actII-orf4的转录水平变化.结论:来源于S.rimosus M527的otrA基因在天蓝色链霉菌M145中实现异源表达.一方面对宿主天蓝色链霉菌形态分化、放线紫红素产量的影响表明otrA可能作为一种类似延伸因子的发挥重要作用;另一方面宿主对土霉素及氨基糖苷类抗生素抗性的提高可能归因于OTRA对核糖体的保护作用.

目的 应用生物信息学软件预测结核分枝杆菌PhoP基因编码蛋白的结构和功能. 方法 从NCBI数据库获取PhoP基本的基因信息及其编码序列氨基酸信息;应用ProtParam软件预测PhoP蛋白的理化性质;利用SignalIP4.1和TMHMM分析其信号肽和跨膜区;利用在线分析Expasy工具分析蛋白二级结构,建立蛋白三级结构模型;采用Bepipred 1.0 Server和SYFPEITHI分析蛋白的B细胞及T细胞抗原表位. 结果 PhopP蛋白共250个氨基酸,分子式为C1226H1974N346O364S4,原子总数3 914,半衰期为30 h,预测该蛋白为稳定性亲水性蛋白;二级结构中α-螺旋、β-转角、β-折叠、无规则卷曲分别占36.03％、10.58％、24.7％和27.94％,预测的B细胞、CTL细胞抗原表位分别为21个和7个;PhoP基因与天蓝色链霉菌同源性较高;其编码蛋白的相互作用蛋白为PhoR、senX3、trcS等. 结论 生物信息学分析PhoP为稳定蛋白,且含有潜在的B、T细胞抗原表位,是结核病诊断及治疗的潜在候选因子.

从天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor克隆得到海藻糖合酶基因(Sc TreS),在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行了异源表达,通过Ni-NTA亲和柱对表达产物进行分离纯化得到纯酶,经SDS-PAGE测定其分子量约为62.3 kDa.研究其酶学性质发现该酶最适温度35℃;最适pH 7.0,对酸性条件比较敏感.通过同源建模和序列比对分析,对该基因进行定点突变.突变酶K246A比酶活比野生酶提高了1.43倍,突变酶A165T相对提高了1.39倍,海藻糖转化率分别提高了14％和10％.利用突变体重组菌K246A进行全细胞转化优化海藻糖的合成条件并放大进行5L罐发酵,结果表明:在麦芽糖浓度300 g/L、初始反应温度和pH分别为35℃和7.0的条件下,转化率最高达到71.3％,产量为213.93 g/L;当底物浓度增加到700 g/L时,海藻糖产量仍可达到465.98 g/L.

[背景]链霉菌属于放线菌科,在土壤环境中广泛分布.链霉菌具有复杂的形态分化和多样性的次生代谢网络,能产生大量具有生物活性的次级代谢产物,被广泛深入研究.[目的]天蓝色链霉菌是链霉菌的模式菌株,其脂肪酸合成代谢与次级代谢联系紧密,但目前脂肪酸合成代谢途径还不清楚,其长链3-酮脂酰ACP合成酶还未见报道.[方法]利用大肠杆菌FabF序列进行同源比对,发现天蓝色链霉菌A3(2)的基因组中,SC02390 (ScoFabFl)、SC01266 (ScoFabF2)、SC00548(ScoFabF3)和SC05886 (ScoRedR)具有较高的相似性,并具有保守的Cys-His-His催化活性中心,可能具有长链3-酮脂酰ACP合成酶活性.采用PCR扩增方法分别获得以上基因,连入表达载体pBAD24M后分别互补大肠杆菌abB(ts)突变株和fabB(ts)fabF双突变株,并检测转化子的生长情况.以上基因与pET-28b连接后,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,并利用Ni-NTA纯化获得蛋白,体外测定其催化活性.将以上基因分别互补大肠杆菌abF突变株后,GC-MS测定互补株的脂肪酸组成.[结果]4个同源基因中,只有SeofabF1能恢复abB(ts)fabF双突变株42℃时在添加油酸条件下的生长,其他3个基因均不能恢复生长.而这4个基因都不能恢复abB(ts)突变株42℃时生长.体外活性测定ScoFabF1具有长链3-酮脂酰ACP合成酶活性,其他3个蛋白都不具有该活性.仅ScofabF1能显著提高大肠杆菌abF突变株的顺-11-十八碳烯酸(C18∶1)比例,其他3个基因都不具有该功能.[结论]天蓝色链霉菌中ScofabF1编码长链3-酮脂酰ACP合成酶Ⅱ,在脂肪酸利用过程中发挥重要作用.天蓝色链霉菌中没有发现编码长链3-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ的基因,其可能通过其他途径合成少量的不饱和脂肪酸.以上研究结果为进一步研究天蓝色链霉菌中脂肪酸合成机制奠定了基础.

基于Ⅰ型羊毛硫肽独特的抑菌机制及其在抗耐药菌治疗领域极强的应用潜能,通过对海洋链霉菌W007基因组的深度挖掘,发现了新颖的Ⅰ型羊毛硫肽合成基因簇,并解析了其组成.以pJTU2554为建库载体构建了链霉菌W007基因组文库,通过菌液PCR策略筛选获得了包含完整基因簇的阳性文库克隆,将阳性文库克隆电击转化到大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中,并与天蓝色链霉菌M145和变铅青链霉菌TK24进行了接合转移,构建了Ⅰ型羊毛硫肽合成基因簇的异源表达体系.通过对基因簇上的簇内基因进行PCR验证,发现该新颖Ⅰ型羊毛硫肽合成基因簇成功导入了变铅青链霉菌TK24和天蓝色链霉菌M145中,结合抗菌活性和次级代谢谱的分析结果,证实该基因簇在变铅青链霉菌TK24中获得成功表达.虽然该Ⅰ型羊毛硫肽合成基因簇的异源表达体系已经成功建立,但是该基因簇在异源表达宿主内的表达水平及目标产物的鉴定还有待进一步确定.该研究为具有潜在应用价值的新颖Ⅰ型羊毛硫肽的发现及其独特的生物合成机制的解析奠定了基础.

放线菌是一类革兰氏阳性细菌,可产生氨基酸等初级代谢产物和抗生素等次级代谢产物,其广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业.此外,还有少数放线菌,如分枝杆菌等,是可以引起人和动植物病害的病原菌.亮氨酸应答调控蛋白(Leucine-responsive regulatory protein,Lrp)是一类在氨基酸代谢及其相关代谢过程中的重要转录调控子,能够应答各种氨基酸,参与调控微生物细胞的多个生理过程,例如氨基酸代谢和转运、中心代谢、细菌的持久性和毒力等.本文总结了放线菌Lrp的生物学功能,并综述了放线菌中不同种属Lrp以及天蓝色链霉菌和红色糖多孢菌Lrp调控机理的研究进展.

[背景]生物产生的天然色素在工业、农业和纺织工业上有潜在应用价值.[目的]通过对产色素海洋放线菌的分离与筛选,为开发细菌所产生的天然色素在纺织与食品工业中的应用奠定基础.[方法]筛选胞外产可溶性色素的放线菌,并通过16SrRNA基因序列测定和分析构建其系统发育树,并对影响色素产量的因素和色素稳定性进行实验.[结果]获得了一株产蓝色色素的放线菌Q2N-42和一株产黄绿色色素的放线菌X4C-5,16S rRNA基因序列分析表明它们分别与天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)或紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)和普拉滕斯链霉菌(Streptomyces pratensis)的16S rRNA基因序列存在较高的相似性.通过研究不同碳源和氮源对放线菌Q2N-42和X4C-5产色素的影响,发现甘油和硝酸钠能明显地增加天蓝色链霉菌(S.coelicolor)Q2N-42的色素产量,而淀粉和硝酸钠能明显地增加普拉滕斯链霉菌(S.pratensis)X4C-5的色素产量.这两种色素对不同浓度的氧化剂、还原剂、盐和pH都表现出良好的稳定性;色素的红外光谱测定表明,其结构分别包含了-OH、-CH3和C=C基团.通过色素和不同媒染剂对棉线染色,发现硫酸铜是蓝色色素良好的媒染剂,毛线着色较深,洗涤不易脱色;而硫酸亚铁是绿色色素良好的媒染剂,毛线着色较深、有光泽,洗涤不易脱色.[结论]放线菌株Q2N-42和X4C-5所产生的色素为其工业应用提供了潜在的天然色素资源.

本文以天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)中黄色色素coelimycin生物合成调控及开发策略的研究进展为代表,介绍了链霉菌中沉默生物合成基因簇调控激活的新进展,为链霉菌天然产物基因簇的挖掘和新次级代谢产物的发现提供研究思路.