目的 优化天马颗粒剂的最佳配方.方法 天马颗粒剂的17味药物按L20(217)正交表分为20组,并通过对20组大鼠灌胃获取含药血清.用5％、10％、20％含药血清分别对人大肠癌细胞HCT8、HCT116、HT29、COL0320、SW480、SW620干预24、48、72h,CCK-8法检测细胞的吸光度,比较各组含药血清对细胞的增殖抑制率.结果 经直接分析和方差分析,原方中蜈蚣、全蝎、半边莲、黄柏、三棱、大黄、胆南星、海藻、黄芪、山药均在大肠癌细胞的增殖抑制中发挥主要作用(均P<0.05,P<0.01),而其它药物则无明显作用(均P>0.05).结论 根据正交设计优选天马颗粒剂的最佳配方为:蜈蚣、全蝎、半边莲、黄柏、三棱、大黄、胆南星、海藻、黄芪、山药.

目的:探讨天马颗粒剂抑制人结肠癌细胞株SW480增殖的作用,并对其增殖抑制作用机制进行初步探讨.方法:采用不同质量浓度的天马颗粒剂(10 -1g·mL-1、10 -2g·mL-1、10 -3g·mL-1及10 -4g·mL-1) 处理人结肠癌细胞株SW480,同时设立空白对照组(RPMI 1640培养液处理)及阳性对照组 (以5-氟尿嘧啶处理).观察SW480细胞的形态学动态变化,以MTT法检测各组SW480细胞的增殖情况,另以速率法检测各组SW480细胞中碱性磷酸酶(alkaline phos-phatase,AKP)比活性的变化情况.建立人结肠癌细胞株SW480免疫抑制小鼠肾包膜下移植瘤模型,同时设立天马颗粒剂组(天马颗粒剂灌胃),空白对照组(生理盐水灌胃)及阳性对照组(5-氟尿嘧啶腹腔注射),8 d后采集肿瘤组织,以免疫组织化学法及图像分析技术定量检测各组移植瘤SW480细胞中Ki-67及PCNA基因的表达情况.结果:随着天马颗粒剂质量浓度的增加,SW480细胞逐渐稀疏,散在生长,细胞变大,透明度差,颗粒增多;当天马颗粒剂质量浓度为10 -4 g·mL- 1时,SW480细胞颜色加深,且部分细胞从瓶壁脱落,甚至部分细胞可见坏死崩解的碎片;实验组10 -1g·mL-1、10 -2g·mL-1、10 -3g·mL-1及10 - 4g·mL-1的天马颗粒剂均可显著抑制SW480细胞增殖,且随天马颗粒剂作用时间延长及质量浓度增大,SW480活细胞计数逐渐降低(P＜0.05);随着质量浓度的增加OD值逐渐降低,增殖抑制率逐渐升高(P＜0.05); 10 -1g·mL-1、10 -2g·mL-1、10 -3g·mL-1及10 -4g·mL-1的天马颗粒剂均会使SW480细胞的 AKP比活性升高,且以10 -2g·mL-1时的AKP比活性最高,且显著高于其他各组(P＜0.05或P＜0.01).阳性对照组AKP比活性与空白对照组比较,差异无统计 学意义(P＞0.05); Ki-67及PCNA基因主要表达于SW480细胞的细胞核,天马颗粒剂组及阳性对照组Ki-67及PCNA基因阳性着色较空白对照组明显减少,其表达的 面积均值及积分光密度均显著降低(P＜0.01).结论:天马颗粒剂可显著抑制人结肠癌细胞株 SW480 增殖,原因可能与其诱导 SW480 细胞成熟分化或抑制 SW480细胞Ki-67及PCNA基因表达相关.

克罗恩病属于肛肠科疑难杂症,后期多伴有结直肠狭窄,治疗上颇为棘手.目前,尚未研制出根治克罗恩病的药物.何永恒教授认为本病属本虚标实之证,脾虚气滞、毒瘀互结于肠道是其发病的主要病机,采用辨病与辨证相结合的方法,遵循益气活血、化瘀解毒、软坚散结的治疗原则,采用天马颗粒、白芍七物颗粒、枳实通降颗粒等专利方为主治疗,取得了较好的治疗效果.

结直肠癌为临床常见恶性肿瘤.何永恒教授认为结直肠癌病机为本虚标实."虚"为本虚,多为五脏亏虚,尤其以脾肾亏虚最明显,临床上以健脾补肾为要;标实则主要为"毒",根据其病理因素又可分为癌毒、湿毒、热毒、痰毒、瘀毒,据此提出解毒八大法则,分别为以毒攻散癌毒法、清热除湿解毒法、化痰软坚解毒法、活血化瘀解毒法、益气扶正解毒法、养血活血解毒法、滋阴温阳解毒法和健脾补肾解毒法;并创制"天马颗粒剂",临床疗效明显.

目的 研究天马颗粒通过FLI-1/Klotho途径对结肠癌细胞(HCT116)增殖抑制的作用机制.方法 将HCT116细胞分为blank组、shRNA组、shTMKL组、TMKL组.blank组为空白对照,shRNA组为HCT116细胞瞬时转染FLI-1 shRNA,shTMKL组为shRNA组基础上加入天马颗粒血清干预,TMKL组为天马颗粒血清干预HCT116细胞.各组细胞培育24 h后,进行后续实验检测.qPCR检测各组细胞FLI-1 mRNA和Klotho mRNA表达;Western blot法检测各组细胞FLI-1蛋白和Klotho蛋白相对表达;流式细胞术检测各组细胞周期及凋亡,并计算S期细胞比值(S-phase fraction,SPF);CCK-8法检测各组细胞增殖.结果 与blank组相比,shRNA组、shTMKL组FLI-1、Klotho蛋白及mRNA表达量降低(P<0.05),TMKL组FLI-1、Klotho蛋白及mRNA表达量升高(P<0.05);与shRNA组相比,shTMKL组FLI-1、Klotho蛋白及mRNA表达量差异无统计学意义(P>0.05),TMKL组FLI-1、Klotho蛋白及mRNA表达量升高(P<0.05);与shTMKL组相比,TMKL组FLI-1、Klotho蛋白及mRNA表达量升高(P<0.05).与blank组相比,shRNA组HCT116细胞增殖能力增强(P<0.05)、SPF值升高(P<0.05)、凋亡率下降(P<0.05),shTMKL组、TMKL组HCT116细胞增殖能力受到抑制(P<0.05)、SPF值降低(P<0.05)、凋亡率升高(P<0.05);与shRNA组相比,shTMKL组、TMKL组HCT116细胞增殖能力受到抑制(P<0.05)、SPF值降低(P<0.05)、凋亡率升高(P<0.05);与shTMKL组相比,TMKL组HCT116细胞增殖能力受到抑制(P<0.05)、SPF值降低(P<0.05)、凋亡率升高(P<0.05).结论 天马颗粒可通过FLI-1基因调控Klotho蛋白表达,进而抑制HCT116细胞增殖、诱导凋亡.

目的 研究天马颗粒对结直肠癌细胞中Friend白血病整合素1转录因子(Friend leukemia integration 1,FLI-1)启动子甲基化的作用机制.方法 以结直肠癌细胞HCT116、HT29、Caco-2为研究对象,每种细胞分为3组:Blank组、NC组、TMKL组.Blank组为空白对照,NC组予以空白血清干预,TMKL组予以天马颗粒血清干预.采用CCK8筛选天马颗粒血清最佳干预浓度,Western blot检测各组细胞中FLI-1蛋白表达,qPCR法检测各组细胞FLI-1 mRNA表达,ELISA法检测DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)、DNA甲基转移酶3a(DNA methyltransferase 3a,DNMT3a)蛋白表达,甲基化特异性PCR(methyla-tion-Specific PCR,MSP)检测各组细胞中FLI-1启动子甲基化.结果 天马颗粒血清对HCT116、HT29和Caco-2细胞增殖有抑制作用,其中20％的天马颗粒血清浓度抑制效果最佳.在HCT116细胞分组和Caco-2细胞分组中,同Blank组、NC组相比,TMKL组FLI-1蛋白及mRNA表达升高(P<0.05),Blank组同NC组相比差异无统计学意义(P>0.05);在HT29细胞分组中,Blank组、NC组和TMKL组FLI-1蛋白及mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05).在HCT116、HT29和Caco-2细胞中,同Blank组、NC组相比,TMKL组DNMT1、DNMT3a的表达量下降(P<0.05),Blank组同NC组相比差异无统计学意义(P>0.05);在HCT116细胞中,同Blank组、NC相比,TMKL组细胞FLI-1启动子产生了部分去甲基化,甲基化减弱,非甲基化增多,NC组同Blank相比无变化;在HT29细胞中,Blank组、NC组和TMKL组细胞FLI-1启动子无甲基化;在Caco-2细胞中,同Blank组、NC相比,TMKL组细胞FLI-1启动子完全去甲基化,NC组同Blank相比无变化.结论 天马颗粒可能通过抑制DNMT1、DNMT3a蛋白表达,促使结直肠癌细胞中FLI-1启动子去甲基化,进而上调其表达.