目的 研究 Delta/Notch 样表皮生长因子相关受体(delta/notch-like epidermal growth factor-related receptor,DNER)在胃癌中的作用及其调节机制.方法 通过实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)检测胃癌组织和细胞中DNER mRNA和蛋白表达水平.构建沉默DNER表达的胃癌细胞系SGC7901,用线粒体动力相关蛋白(dynamin-related protein 1,DRP1)抑制剂Mdivi-1处理细胞.CCK-8法、Transwell实验和流式细胞术分别检测细胞活力、侵袭能力和细胞凋亡.Western blot检测DNER蛋白、凋亡相关蛋白[半胱天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate-specific proteinase-3,Caspase-3)、Bcl-2 相关 X 蛋白(Bcl-2 associated X,Bax)]、自噬相关蛋白[微管相关蛋白 1 轻链 3-Ⅱ/Ⅰ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ/Ⅰ,LC3 Ⅱ/Ⅰ)、p62,PTEN 诱导激酶 1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)和Parkin],以及线粒体裂变和融合蛋白[DRP1,线粒体分裂因子(mitochondrial fission factor,MFF)、线粒体分裂蛋白 1(fission mitochondrial 1,FIS1)、视神经萎缩蛋白 1(optic atrophy 1,OPA1)、线粒体融合蛋白1(mitofusin 1,MFN1)和MFN2]水平.结果 胃癌肿瘤组织和细胞中DNER mRNA,蛋白表达水平分别显著高于相邻正常组织(t=-52.485,-46.955)和人正常胃上皮细胞(F=60.551,60.652),差异具有统计学意义(均P＜0.001).沉默DNER显著抑制SGC7901细胞的增殖和侵袭、诱导细胞凋亡、增加细胞凋亡相关蛋白表达,差异具有统计学意义(t=8.026～25.903,均P＜0.05).沉默DNER显著升高LC3 Ⅱ/Ⅰ比率(t=18.086),降低p62蛋白水平(t=6.747),促进PINK1和Parkin蛋白在线粒体的聚集(t=15.630,18.171),抑制线粒体融合蛋白OPA1,MFN 1和MFN2表达(t=12.835,8.963,9.732),促进线粒体裂变蛋白DRP1,MFF和FIS1表达(t=16.034,16.939,15.971),差异具有统计学意义(均P＜0.05).Mdivi-1处理可抵消沉默DNER对胃癌细胞线粒体自噬及细胞增殖、侵袭和凋亡的影响.结论 DNER通过抑制线粒体动力学失衡减少线粒体自噬,促进细胞增殖和侵袭,抑制细胞凋亡,从而促进胃癌进展.

目的 探讨LED光源照射对人视网膜色素上皮(RPE)细胞自噬和凋亡的影响,以及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002在光照下对RPE细胞自噬和凋亡的影响.方法 体外培养人ARPE-19细胞,随机分为6 h对照组、6 h模型组、6 h LY294002组,12 h对照组、12 h模型组、12 h LY294002组,24 h对照组、24 h模型组、24 h LY294002组,分别给于设定时间的LED冷光照射或加入LY294002后的光照.采用噻唑蓝法检测各组细胞存活率;流式细胞术检测各组细胞凋亡率;透射电子显微镜观察各组细胞超微结构;构建稳定表达红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3(LC3)的RPE细胞株,激光共聚焦合倒置荧光显微镜分析细胞自噬流变化;Western blot法检测苄氯素1(Beclin 1)、LC3和p62自噬相关蛋白表达水平.结果 与对照组比较,6、12、24 h模型组细胞存活率均下降(均P＜0.05),12、24h LY294002组细胞存活率均下降(均P＜0.01);与模型组比较,12、24 h LY294002组细胞存活率均升高(均P＜0.05).与对照组比较,6、12、24 h模型组和LY294002组细胞凋亡率均升高(均P＜0.05);与模型组比较,6、12h LY294002组细胞凋亡率均下降(均P＜0.05).模型组RPE细胞在光照24 h后,胞内可见较多的自噬泡,LY294002干预后也可见聚集性分布的自噬囊泡.观察自噬流发现,对照组少见红色亮点,模型组红色亮点荧光随光照时间延长数量逐渐增多,Merge图中黄色亮点数量增多明显,LY294002干预后,红色亮点与黄色亮点呈增多趋势.与对照组比较,6、12、24 h模型组和LY294002组细胞中Beclin 1、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ蛋白表达水平均升高,p62蛋白表达水平均下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05);与模型组比较,6、12、24 h LY294002组细胞中Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ蛋白表达均升高,12、24 h LY294002组细胞中p62蛋白表达水平均下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 LED光源照射可刺激ARPE-19细胞发生自噬,增加细胞凋亡率;PI3K抑制剂LY294002能上调细胞的自噬活性,减缓凋亡.

目的 通过在verubulin(1)结构中的喹唑啉环2位引入MP-HJ-1c(3)结构中的吡咯并[2,3-d]噻唑-5-甲酰胺基团,发现新结构类型的微管聚集抑制剂.方法 将化合物1的衍生物2和3与微管蛋白的复合晶体结构6BR1、5YZ3进行叠合,设计了分别用亚甲基或1,2-亚乙基将1喹唑啉环2位与3中吡咯并[2,3-d]噻唑-5-甲酰胺基进行连接得到的目标化合物4a和4b,并进行了分子对接.4a和4b经酰胺缩合、分子内成环、亲核取代和酰胺缩合4步反应合成,总收率分别为7.9%、11.3%,结构经 1H-NMR、13C-NMR和HR-ESI-MS确证.评价了4a和4b对人肺癌细胞A549增殖的抑制活性和微管聚集的抑制活性.结果 分子对接结果显示,4a与5YZ3的结合能为-27.93 kcal·mol-1,来源于1、3的结构部分各自基本维持了与微管蛋白的相互作用方式.4a和4b的A549增殖抑制活性分别为(0.15±0.03)μmol·L-1 和(9.91±1.04)μmol·L-1(GI50 值);仅4a表现出微弱的微管聚集抑制活性[(67.1±11.1)μmol·L-1(IC50值)].结论 设计的化合物4a表现出一定的体外肿瘤细胞增殖抑制活性和微管聚集抑制活性,可作为先导化合物,进一步对其结构中的N-甲基-4-甲氧基苯环部分进行构效关系研究.4b经体外测试无明显微管聚集抑制活性,与分子对接中由于连接链过长导致吡咯并[2,3-d]噻唑-5-甲酰胺基无法与微管蛋白形成有效相互作用的结果一致.

阿尔茨海默病(AD)是一种常见的神经退行性疾病,占所有痴呆病例的60％～80％,可导致认知功能受损[1].流行病学调查显示,中国60岁以上人口中痴呆患者约1507万,其中AD患者约983万[2].目前AD的常用治疗药物包括乙酰胆碱酯酶抑制剂和非竞争性N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂,这两类药物可改善症状,但不能逆转大脑神经元的损伤.因此,迫切需要对AD进行疾病修饰治疗.AD的主要病理特征是脑内细胞外β淀粉样蛋白(Aβ)的沉积和细胞内由tau蛋白组成的神经纤维缠结[3].靶向病理性tau蛋白的治疗已成为目前的研究热点[4].目前在研究的靶向tau蛋白的AD治疗药物主要包括针对tau蛋白翻译后修饰、抑制tau蛋白聚集、促进tau蛋白降解、稳定微管的化学药物及基因治疗、免疫治疗等.我们主要对近5年内相关药物的临床试验进展进行综述,为AD的药物治疗提供参考.

目的 研究小鼠卵母细胞减数分裂进程中活化的LIMK1(pLIMK1Thr508)与Aurora-A亚细胞分布的相关性, LIMK1活性变化对Aurora-A和纺锤体组装的影响.方法 收集21日龄CB6F1小鼠卵母细胞,分别体外培养至生发泡期(GV)、生发泡破裂期(GVBD)、第1次减数分裂中期(MI)、第1次减数分裂后期(AI)和末期(Tel I)以及第2次减数分裂中期(MII),固定并利用免疫荧光染色法分析减数分裂进程中pLIMK1Thr508的亚细胞定位模式及其与纺锤体组装调控因子Aurora-A的时空相关性;利用抑制剂BMS-3处理MI期细胞,结合免疫荧光染色分析LIMK1活性缺失对于Aurora-A空间分布和纺锤体形成的影响.结果 在小鼠卵母细胞减数分裂前期(prophase)(即GV期), pLIMK1Thr508信号微弱并主要聚集于生发泡,此时 Aurora-A 在胞内没有特殊聚集;在临近减数分裂重启时, pLIMK1Thr508离开生发泡,Aurora-A 信号出现,两者呈高度致密的点状聚集并紧密重合;在生发泡完全破裂后, pLIMK1Thr508和Aurora-A又呈多个点片状聚集在凝集的染色体周围;在MI期和MII期,pLIMK1Thr508与Aurora-A共同定位于纺锤体两极;在从AI期到Tel I期进程中pLIMK1Thr508离开纺锤体两极,聚集在收缩环部位,Aurora-A在纺锤体两极有微弱聚集.LIMK1抑制剂BMS-3能够破坏 Aurora-A在纺锤体两极的聚集,并影响纺锤体结构.结论 pLIMK1Thr508在卵母细胞减数分裂中是一种微管组织中心(MTOC)相关蛋白,可能通过调控Aurora-A而参与纺锤体结构的形成和维持.

目的 探讨动力蛋白在帕金森病发病中的作用及其机制.方法 采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)腹腔注射的方法在C57BL/6雄性小鼠建立帕金森病模型,并以动力蛋白ATP酶活性抑制剂EHNA(erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine hydrochloride)进行干预,同时分别设立雷帕霉素或3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)干预对照及正常对照.各组小鼠在最后1次药物或生理盐水注射后1、7、14d进行行为学评价,14d时处死小鼠,取中脑黑质组织行酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫组化染色观察多巴胺能神经元存活数目,Western blot检测动力蛋白、α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)和自噬标记蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)的表达.结果 ①与模型组比较,EHNA作用使得帕金森病小鼠行为学障碍加重,爬杆时间进一步缩短,旷场试验总距离及平均速度进一步减少,3-MA干预同样会加重上述行为学症状,雷帕霉素则能改善模型小鼠的行为学障碍;②模型小鼠较正常对照组动力蛋白表达减少,自噬蛋白LC3-Ⅱ表达增加,α-Syn蛋白表达增加,黑质TH阳性神经元存活数目减少[(24.3 ± 5.3)vs.(64.2 ± 7.2),P<0.01],EHNA作用可进一步减少动力蛋白的表达和黑质 TH 阳性神经元数目[(18.5 ± 3.5)vs.(24.3 ± 5.3),P<0.05],减少自噬蛋白LC3-Ⅱ表达,并使得α-Syn蛋白表达进一步增加.动力蛋白与α-Syn蛋白表达负相关(r= -0.922,P<0.01),与LC3-Ⅱ蛋白(r=0.929,P<0.01)以及TH阳性神经元数目(r=0.871,P<0.01)呈正相关;③自噬抑制剂3-MA使模型小鼠自噬蛋白LC3-Ⅱ表达进一步减少,α-Syn蛋白表达进一步增加,黑质TH阳性神经元数目相应减少,此结果与EHNA干预类似,而自噬诱导剂雷帕霉素干预的结果刚好相反.结论 动力蛋白参与PD的发病过程,其机制可能与动力蛋白受损抑制细胞自噬功能,致使α-Syn出现自噬性清除障碍,继而导致α-Syn异常聚集和DA神经元损伤有关.

目的:研究氢分子对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导巨噬细胞凋亡的影响,并探讨可能的分子机制.方法:体外培养鼠源RAW264.7巨噬细胞,处理前更换为饱和含氢培养基,分别给予3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA;5 mmol/L)和雷帕霉素(rapamycin,Rap;3μmol/L)预处理1 h,再加入ox-LDL(100 mg/L)继续培养24 h.分别采用MTT法和Annexin V-FITC双染法检测细胞活力和凋亡情况,试剂盒测定培养基中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性,Western blot法检测自噬标志分子beclin-1和内质网应激相关促凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)表达的变化,激光共聚焦显微镜观测细胞内微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)的表达变化.结果:氢分子显著抑制ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞活力降低、LDH漏出增加、细胞凋亡及CHOP表达上调;ox-LDL诱导巨噬细胞自噬反应,表现为beclin-1表达上调,LC3颗粒化聚集,而氢分子可进一步促进ox-LDL对细胞自噬的诱导作用,且氢分子的这种促进作用可被自噬抑制剂3-MA拮抗,而被自噬诱导剂Rap增强(P<0.01).另外,氢分子对ox-LDL所致的巨噬细胞凋亡、细胞活力降低及CHOP上调的抑制作用也可被3-MA拮抗,而被Rap促进.在体外培养的人源THP-1巨噬细胞中也观察到类似的结果,即氢分子不仅可抑制ox-LDL诱导的细胞凋亡和CHOP上调,也可使beclin-1表达进一步上调(P<0.01).结论:氢分子可通过下调CHOP表达抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡,其上游机制可能是通过激活自噬实现的.

目的 观察桃仁膝康丸(TRXK)对外科手术诱导的大鼠骨性关节炎(OA)软骨退变的保护作用并探讨其与软骨细胞自噬的关系.方法 将健康雄性SD大鼠40只随机分为:假手术组、模型组、TRXK组和TRXK+自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)组,采用改良的Hulth法制备大鼠膝关节OA模型.术后2周开始TRXK组和TRXK+3-MA组给予TRXK 1.25 g·kg-1·d-1灌胃,TRXK+3-MA组同时给予3-MA 1.5 mg·kg-1·d-1腹腔注射,连续用药12周.光镜下观察软骨组织形态学变化,并进行Mankin评分,Real-time PCR法检测膝关节软骨组织中Ⅱ型胶原β1 (COL2A1)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、基质金属蛋白酶13(MMP13)和血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5 (ADAMTS5) mRNA的表达,Western Blot法检测软骨组织中ULK1、Beclin-1和微管相关蛋白1轻链3-Ⅰ/Ⅱ(LC3-Ⅰ/Ⅱ)蛋白质的表达.结果 与模型组比较,TRXK能明显降低Mankin评分,升高软骨组织中COL2A1和Aggrecan,而降低MMP13和ADAMTS5 mRNA表达(P＜0.05);另外,TRXK能提高ULK1、Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白质表达(P＜0.05).结论 桃仁膝康丸可以通过诱导软骨细胞自噬延缓或阻止外科手术诱导的大鼠膝关节OA的软骨退变,其激活软骨细胞自噬的机制有待进一步研究.

[目的]探讨PI3KC3/Beclin1复合物在染矽尘大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)自噬中的调控作用.[方法]常规培养NR8383细胞,随机分为4组:对照组,矽尘组,3-MA组和3-MA干预组,分别孵育1、3、6、12、20h后收集样品.采用蛋白免疫印迹方法检测自噬标记蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬底物蛋白p62以及自噬相关蛋白Beclin1、PI3KC3;采用激光扫描共聚焦显微镜观察孵育不同时间的自噬免疫荧光表达情况;采用免疫共沉淀检测Beclin1复合物表达.[结果]免疫荧光结果显示,矽尘组LC3点状聚集绿色荧光亮斑随时间先增强后减弱,在6h时荧光最强,且各时间点较对照组和3-MA干预组荧光亮斑增强;3-MA干预组LC3荧光标记绿色亮斑先增强后减弱,弱于矽尘组,但强于对照组.加入溶酶体抑制剂二磷酸氯喹后,各组LC3绿色荧光信号随时间均呈现增强的趋势.Western blot结果显示,矽尘组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值呈先增加后减少趋势,且在各个时间点均高于对照组(P＜0.05);在LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值达最高的6h时间点,矽尘组的值是对照组的248％,是3-MA组的372％.3-MA干预组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值也呈先增加后减少趋势;除1h时间点外,余各时间点均低于矽尘组,但高于对照组(P＜0.05);在LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值达最高的6h时间点,3-MA干预组的值是矽尘组的90％,是对照组的223％.Beclin1、PI3KC3蛋白表达趋势与LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值一致,p62蛋白表达趋势与LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值相反.免疫共沉淀显示,矽尘组Beclin1与PI3K结合增加,3-MA干预后两者结合减少.[结论]矽尘诱导NR8383细胞的自噬活动随时间发生不同程度的改变,3-MA可下调矽尘诱导的NR8383细胞自噬活动,推测PI3KC3/Beclin1信号通路参与矽尘诱导肺泡巨噬细胞的自噬过程.

目的 探讨冬虫夏草提取物虫草菌液(Cordyceps sinensis,CS)对高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的影响机制.方法 用细胞增殖与活性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测CS对细胞生存活力的影响;用β-甘油磷酸(β-GP,10 mmol/L))建立大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙化模型,加入CS(10 mg/L)、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA,5 mmol/L)及一磷酸腺苷(AMP)活化的蛋白激酶(AMPK)抑制剂化合物C(CC,10 μmol/L)进行干预,实验分为5组:对照组(Ctrl)、β-GP组、β-GP+CS组、3-MA+β-GP+CS组、CC+β-GP+CS组.通过茜素红S染色及钙测定试剂盒检测各组细胞钙沉积量;透射电镜观察VSMC内自噬体的形成;免疫荧光检测细胞质内微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达;Western印迹法检测血管平滑肌标志物α-SMA蛋白、成骨指标Runx2、自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1及AMPK/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路蛋白.结果 虫草菌液能使高磷环境中血管平滑肌细胞的自噬体、LC3荧光点状聚集及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、α-SMA、磷酸化(p)-AMPK蛋白表达增多,Runx2、p-mTOR蛋白表达及钙沉积减少(均P＜0.01).用3-MA抑制自噬后,β-GP+CS环境中的血管平滑肌细胞α-SMA蛋白表达减少(P＜0.01),Runx2蛋白表达及钙沉积增多(均P＜0.01),提示虫草菌液是通过激活自噬减轻了β-GP诱导的血管平滑肌细胞的钙化.用CC抑制AMPK/mTOR信号通路后,β-GP+CS组的血管平滑肌细胞的p-AMPK蛋白表达明显减少(P＜0.01),且LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ、Beclin1、α-SMA蛋白表达量及自噬体、LC3荧光点状聚集也减少,p-mTOR、Runx2蛋白表达量及钙沉积增多(均P＜0.01),提示虫草菌液是通过激活依赖AMPK/mTOR信号通路的自噬而减轻了β-GP诱导的血管平滑肌细胞的钙化.结论 虫草菌液能有效减轻高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化,其机制可能是通过激活AMPK/mTOR信号通路增强自噬.