该研究旨在通过观察苓桂术甘汤(Linggui Zhugan Decoction,LGZGD)含药血清对心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)纤维化及Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路蛋白分子表达的调控机制.制备空白血清和LGZGD含药血清,胰酶-胶原酶依次消化并结合差速贴壁法分离培养原代CFs,采用免疫荧光标记鉴定原代CFs.设正常对照组,模型组,20％空白血清组,5％、10％、20％LGZGD含药血清组.分别用20％空白血清,5％、10％、20％LGZGD含药血清预处理12 h,除正常对照组,其余5组均加入过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)刺激细胞,建立原代CFs纤维化模型.采用划痕愈合实验观察细胞迁移能力,ELISA法检测Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ,Col Ⅰ)、Ⅲ型胶原(collagen Ⅲ,Col Ⅲ)含量,Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Wnt1、糖原合酶激酶 3β(glycogen synthase kinase 3 beta,GSK-3β)、磷酸化糖原合酶激酶 3β(phospho synthase kinase 3 beta,p-GSK-3β)、β-catenin 及细胞核β-catenin 的蛋白表达,RT-qPCR 检测 β-catenin、基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein 9,MMP9)的基因表达,免疫荧光技术检测关键蛋白α-SMA、β-catenin的表达及定位.制备Wnt1过表达CFs,采用H2O2处理CFs.设正常对照组、模型组、20％LGZGD含药血清组、空载质粒+20％LGZGD含药血清组、Wnt1过表达+20％LGZGD含药血清组.采用ELISA法检测Col Ⅰ、Col Ⅲ的含量与其比值,Western blot法检测α-SMA和Wnt1、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin及细胞核β-catenin的蛋白表达,RT-qPCR检测β-catenin、MMP9的基因表达.免疫荧光染色显示,心肌成纤维细胞Vimentin表达阳性,呈绿色,胞核为蓝色,纯度大于90％,鉴定是原代CFs.结果显示,与正常对照组相比,模型组CFs 愈合率增强,Col Ⅰ、Col Ⅲ 含量升高,Col Ⅰ/Col Ⅲ 比值增大,α-SMA、Wnt1、p-GSK-3β、β-catenin、核β-catenin 蛋白表达上调,GSK-3β蛋白表达降低,β-catenin、MMP9 mRNA表达显著升高,β-catenin、α-SMA荧光强度明显增强,表达量明显增多;与模型组相比,5％、10％、20％LGZGD含药血清能显著抑制细胞迁移能力,减少Col Ⅰ、Col Ⅲ的含量,降低Col Ⅰ/Col Ⅲ比值,下调α-SMA、Wnt1、p-GSK-3β、β-catenin、核 β-catenin 蛋白表达,提高 GSK-3β 表达,减少 β-catenin、MMP9 的 mRNA 表达,降低β-cate-nin、α-SMA荧光强度和表达量;与空载质粒+20％LGZGD含药血清组比,过表达Wnt1后,LGZGD作用被显著逆转.LGZGD能够减少胶原纤维过度沉积,抑制成纤维细胞过度增生,改善心肌纤维化进程.LGZGD改善心肌纤维化的作用与调控Wnt/β-catenin通路,减少胶原沉积,保护心肌细胞有关.

目的 研究D-半乳糖(D-galactose,D-gal)对小鼠睾丸TM4支持细胞连接功能损伤以及淫羊藿素(icaritin,ICT)的改善作用机制.方法 首先将TM4细胞分为正常对照组、不同浓度D-gal处理组,Western blot检测TM4细胞连接功能相关蛋白(ZO-1、Occludin、β-catenin 和 Cx43)以及 ERα/FAK信号通路相关蛋白(ERα、FAK和pY397-FAK)表达水平的变化;随后MTT筛选ICT药物浓度,并将TM4细胞分为正常对照组、D-gal处理组、D-gal处理+不同浓度ICT组,Western blot检测上述蛋白表达水平变化;分子对接研究ERα与ICT之间的相互作用,并预测两者之间的亲和力;最后将TM4细胞分为正常对照组、D-gal处理组、ERα抑制剂组、D-gal+ICT组、ERα抑制剂+ICT组,Western blot检测上述蛋白表达水平的变化.结果 D-gal可浓度依赖性下调连接功能相关蛋白(ZO-1、Occludin、β-catenin 和 Cx43)以及 ERα/FAK信号通路相关蛋白(ERα、FAK和pY397-FAK)表达水平;给予ICT药物后,上述蛋白表达水平均明显上调;ERα和ICT分子对接结果显示,ERα的Asp351氨基酸残基与ICT之间形成2个距离为3.4 ?和2.4 ?的氢键,且两者之间的对接结合能小于-7 kcal·mol-1;ERα抑制剂处理TM4细胞后,上述蛋白表达水平均明显下调,给予ICT后,上述蛋白表达水平未有明显变化.结论 D-gal可导致TM4细胞连接功能损伤,而ICT可改善其损伤,机制可能与上调ERα/FAK信号通路相关.

目的 探讨H3 G34突变型弥漫型半球胶质瘤(H3 G34-mutant diffuse hemisphere glioma,DHG-G34)的临床病理特征,并分析其免疫表型、分子特征和预后.方法 复习3例DHG-G34病例资料,光镜下分析其组织学特点和免疫表型,结合分子改变和随访结果评估该肿瘤临床病理特征和预后.结果 例1、例2位于右侧额叶,例3累及双侧额叶、左侧颞岛叶及基底核区等多个脑叶.术前影像2例额叶病变均显示皮质及交界区囊实性占位,增强扫描囊壁及实性部分强化;例3显示多个脑叶呈不规则异常信号影,强化不明显.显微镜下2例额叶病变均呈胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)改变,在GBM背景中可见密集分布未分化小细胞,呈原始神经外胚层肿瘤(primitive neuroectodermal tumour,PNET)改变.例3肿瘤累及多个脑叶,呈2～3级星形细胞瘤形态.免疫组化肿瘤细胞胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)均阳性,但少突胶质细胞转录因子2(oligodendrocyte transcription factor 2,Olig-2)、异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)1/2、地中海贫血伴智力低下综合征X连锁(alpha-thalassemia X-linked intellectual,ATRX)、O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶启动子(O6-methylguanine-DNA methyltransferase promoter,MGMT)和BRAF V600E均阴性.1例P53呈强阳性,2例P53表达完全缺失(无义突变);2例H3 G34R呈弥漫核强阳性,1例H3 G34V阳性.3例均行病灶切除术,例2术后未辅助放化疗,3个月后肿瘤即复发.例1和例3术后行放化疗,在术后12和17个月出现肿瘤进展.结论 DHG-G34是一种累及青少年和年轻成人大脑半球的高级别胶质瘤,具有特征性免疫表型和分子改变,患者预后差,但优于IDH野生型GBM和弥漫性中线胶质瘤(H3K27变异型).

目的:探讨miR-141-3p对氧化应激状态下角质形成细胞的保护作用及其分子机制.方法:体外过氧化氢(H2O2)预处理角质细胞,选择 miR-141-3p mimics/inhibitor 以及 siKEAP1 技术研究 miR-141-3p 对于KEAP1/Nrf2 信号通路的影响.采用CCK-8 法检测细胞活力,qRT-PCR检测mRNA水平,Western-blot法检测蛋白表达水平,双荧光素酶报告基因系统检测miR-141-3p靶基因,DCFH-DA探针检测胞内ROS水平,酶联免疫吸附试验法检测抗氧化酶活性,EDU法检测细胞增殖功能,细胞划痕实验检测细胞迁移功能.结果:过表达miR-141-3p增强了H2O2 处理下角质形成细胞的增殖和迁移能力,降低了胞内ROS水平,并提高了SOD和GSH-px活性;miR-141 可靶向负调控KEAP1,上调Nrf2 和HO-1 表达,发挥抗氧化应激作用;siKEAP1 抑制了miR-141-3p促增殖、促迁移和抗氧化的作用.结论:miR-141 能够通过KEAP1/Nrf2 信号通路有效减轻H2O2 诱导的角质形成细胞氧化应激损伤,并促进其增殖和迁移,从而发挥促进糖尿病创面愈合的作用.

心血管疾病是全世界人口死亡的主要原因.过度的氧化应激和炎症在心血管疾病的发生发展中起着重要作用.研究表明,氢分子具有抗氧化、抗炎和抗细胞死亡等多种生物学效应,具有保护心脏的作用.同时氢分子具有穿透力强、作用特异性高且温和高效并且安全性高的特性,因此成为新的研究热点.然而,其作用的确切细胞内机制尚不清楚,仍有待科研人员进一步探索.氢气存在低溶解度、靶向性不强、生物半衰期短等问题,现有的给药方法无法很好地解决,未来是否存在创新技术来减轻这些挑战,本文进行了评述.

目的:熟悉极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(very long-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency，VLCADD)的临床表现，加强临床鉴别诊断，增强临床救治能力。方法:总结2019年我院遗传中心筛查并于NICU收治的1例VLCADD患儿出生后临床表现、检测结果与随访过程，结合病例及文献进行分析。结果:患儿出生后表现为新生儿低血糖症，同时一般实验室检测异常；经串联质谱及基因检测确诊为VLCADD患者，虽经营养支持与对症治疗，但仍未能扭转患儿状况，于诊断1周后死亡。结论:VLCADD作为临床上罕见遗传病，鉴别诊断困难。疑似患者应尽早进行串联质谱筛查与分子生物学诊断，VLCADD的诊断时间与分型明显影响患者的预后与生活质量。

目的:基于网络药理学分析左金丸治疗胃食管反流病的作用机制。方法:通过TCMSP检索左金丸的有效成分及蛋白靶点，在Uniprot数据库中将蛋白靶点名称转化为基因名，运用Cytoscape 3.7.1绘制左金丸有效成分-靶点-药物网络并进行拓扑参数分析，通过在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）、GeneCards、DRUGBANK数据库查找胃食管反流病靶点，找到药物与疾病的交集靶点，在STRING 11.0中对交集靶点进行蛋白相互作用（PPI）网络分析，运用Metascape数据库对交集靶点进行富集分析，运用Cytoscape 3.7.1绘制药物有效成分-靶点-通路网络，并进行网络拓扑参数分析。结果:左金丸治疗胃食管反流病的主要有效成分为槲皮素、吴茱萸次碱、R-四氢小檗碱、1-methyl-2-nonyl-4-quinolone、小檗碱等，主要作用靶点有PTGS2、NOS3、MAPK1、EGFR、TNF、IL6、ERBB2、VEGFA、EGF、IL1B等，通过调控炎症反应、癌症、细胞增殖与凋亡、细胞连接等途径发挥作用。结论:左金丸治疗胃食管反流病是一个多成分、多靶点、多通路的复杂过程，可为今后相关作用机制研究提供参考。

缺血再灌注损伤是导致移植皮瓣部分或全部坏死的重要因素，人们一直在探求改善皮瓣缺血再灌注损伤的方法。研究表明，氢气可通过多种作用方式保护机体，是一种新型的具有高效生物活性的气体分子。近年来，氢气更是作为一种新型皮瓣缺血再灌注损伤抑制剂引起了学者们的广泛关注。氢分子能同时作用于氧化应激、炎性因子释放、细胞凋亡等皮瓣缺血再灌注损伤的多个环节，对治疗具有重大应用价值。

目的:探讨转录因子CCCTC结合因子(CTCF)对翼状胬肉中B淋巴细胞瘤-2基因( Bcl-2)表达的调控及其分子机制。 方法:纳入2017年6月至2019年2月在长沙市第一医院眼科行翼状胬肉切除联合自体角膜缘干细胞移植术治疗的原发性翼状胬肉患者22例，术中收集翼状胬肉组织作为翼状胬肉组；同期纳入因结膜裂伤、眼球破裂伤或眼球穿通伤就诊的眼外伤患者20例，取眼外伤修复手术过程中切取的少量正常结膜组织作为正常结膜组。分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测各组样本中CTCF及Bcl-2的表达水平；采用亚硫酸氢盐处理后测序法(BSP)检测各组样本中Bcl-2启动子DNA甲基化水平。分离并培养翼状胬肉成纤维细胞，使用波形蛋白抗体进行免疫组织化学鉴定成纤维细胞。将分离培养的细胞分成2个组，CTCF干扰组转染CTCF干扰质粒，对照组转染对照质粒。采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测CTCF、Bcl-2表达水平；采用细胞计数试剂盒8检测各组培养12、24和48 h细胞增生活性；采用BSP检测各组样本中Bcl-2启动子DNA甲基化水平。比较各组各指标差异，采用Pearson线性相关分析探讨翼状胬肉组织中Bcl-2 mRNA与CTCF蛋白及 Bcl-2基因启动子甲基化水平的相关性。 结果:翼状胬肉组CTCF mRNA及蛋白相对表达水平分别为7.23±3.34和0.92±0.21，明显高于正常结膜组的1.10±0.44和0.28±0.07，差异均有统计学意义( t＝－8.136、－13.025，均 P<0.01)。翼状胬肉组Bcl-2 mRNA及蛋白相对表达水平分别为10.27±4.64和0.95±0.27，高于正常结膜组的1.10±0.41和0.32±0.14，差异均有统计学意义( t＝－8.789、－10.782，均 P<0.01)。翼状胬肉组CTCF蛋白相对表达量与Bcl-2 mRNA相对表达量呈显著正相关( r＝0.746， P<0.01)。翼状胬肉组Bcl-2启动子区DNA甲基化水平为0.65±0.09，低于正常结膜组的0.83±0.06，差异有统计学意义( t＝7.408， P<0.01)。翼状胬肉组Bcl-2启动子DNA甲基化水平与Bcl-2 mRNA相对表达量呈显著负相关( r＝－0.635， P<0.01)。CTCF干扰组CTCF及Bcl-2 mRNA相对表达水平为0.37±0.03和0.53±0.06，明显低于对照组的1.02±0.06和0.99±0.07，差异均有统计学意义( t＝20.035、9.029，均 P<0.01)；CTCF干扰组CTCF及Bcl-2蛋白相对表达水平为0.23±0.06和0.56±0.07，低于对照组的0.52±0.05和0.92±0.12，差异均有统计学意义( t＝6.914、4.719，均 P<0.01)。CTCF干扰组转染后12、24和48 h细胞活力分别为0.10±0.01、0.17±0.01和0.38±0.04，低于对应时间点对照组的0.12±0.01、0.29±0.01和0.85±0.06，差异均有统计学意义( t＝3.718、18.350、15.621，均 P<0.01)。CTCF干扰组Bcl-2启动子DNA甲基化水平为0.75±0.04，明显高于对照组的0.61±0.03，差异有统计学意义( t＝－4.472， P<0.05)。 结论:翼状胬肉中CTCF高表达，其可能通过下调启动子DNA甲基化水平介导Bcl-2异常表达。

目的:总结儿童髓母细胞瘤神经轴外转移的病例特点。方法:回顾性分析首都医科大学附属北京世纪坛医院2010年4月至2019年4月收治的616例髓母细胞瘤患儿的临床资料，其中11例出现了神经轴外转移。描述性分析患儿的起病年龄、神经轴外转移的部位及时间、病理及分子分型、治疗及预后情况。采用 t检验分析神经轴外转移患者和非转移患者的血生化指标之间的差异。 结果:截至2020年2月，中位随访时间16个月(3~69个月)。随访的616例患儿中有11例出现了神经轴外转移，发病率约为1.8%，其中男8例，女3例。确诊时的中位年龄为6岁(2~10岁)，出现神经轴外转移时的中位年龄为7岁(2~12岁)。神经轴外转移多发生在术后0.5~38.0个月，转移部位依次为骨(6例)、骨髓(3例)、肺(3例)、盆腔(2例)和腹腔(1例)。另外，神经轴外转移患儿的血清乳酸脱氢酶(LDH)水平为(2 298.00±1 570.70) U/L，神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平为(201.00±68.34)μg/L，均高于未发生轴外转移的患儿[(249.50±46.28) U/L和(22.80±7.12) μg/L，均 P<0.05]。神经轴外转移患儿部分接受化疗，但大多选择终末期姑息治疗，生存期多低于10个月。 结论:尽管髓母细胞瘤患儿发生神经轴外转移的发生率很低，但其预后极差，多在1年内死亡；最常见的转移部位为骨，其次为骨髓和肺，可能与脑脊液播散及LDH、NSE水平增高有关。