目的:探讨母体自身免疫性疾病和使用抗凝药物对无创产前检测（non-invasive prenatal testing，NIPT）中母血浆游离DNA胎儿分数的影响。方法:以2021年3月至2022年7月在南京大学医学院附属鼓楼医院行NIPT的单胎妊娠孕妇建立前瞻性队列，应用不需要聚合酶链反应扩增的平台开展NIPT检测。母体自身免疫性疾病包括抗磷脂综合征、未分化结缔组织病、干燥综合征和系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）；抗凝药物包括低分子量肝素（low-molecular-weight heparin，LMWH）及阿司匹林。采用单因素线性回归和多因素线性回归分析NIPT胎儿分数的影响因素。结果:进入队列4 102例单胎妊娠孕妇，排除使用LMWH或阿司匹林时间不明确、其他自身免疫性疾病、单纯促排卵受孕、NIPT结果真阳性及最终检测失败的病例后，余3 948例纳入分析。其中96例合并抗磷脂综合征，35例合并未分化结缔组织病，34例合并干燥综合征，18例合并SLE；108例仅使用LMWH，121例仅使用阿司匹林，113例同时使用LMWH和阿司匹林。单因素回归分析显示，孕妇NIPT采血时体重指数（ B=－0.423）、辅助生殖技术受孕（ B=－0.803）、男胎（ B=－0.458）、合并未分化结缔组织病（ B=1.774）和SLE（ B=3.467）对胎儿分数有影响（ P值均<0.05）。多因素线性回归分析发现NIPT采血时体重指数（ B=－0.415），辅助生殖技术受孕（ B=－0.585）、男胎（ B=－0.322）、合并SLE（ B=3.347）及未分化结缔组织病（ B=1.336）均对胎儿分数有影响（ P值均<0.05）。 结论:应用不需要聚合酶链反应扩增的平台开展NIPT检测时，孕妇使用LMWH和/或阿司匹林对NIPT中母血浆游离DNA胎儿分数无影响；NIPT中母血浆游离DNA胎儿分数受母体自身免疫性疾病中未分化结缔组织病及SLE的影响。NIPT前咨询时应告知孕妇可能因合并的自身免疫性疾病影响母血浆中游离DNA胎儿分数而影响检测结果。

目的 建立扩增孕妇血浆中游离胎儿DNA (cffDNA)的方法,并对该方法在21-三体综合征产前诊断中的应用价值进行分析,以期提高21-三体综合征产前检出率,提高优生率.方法 选择2014年10月～ 2017年4月本院行产前优生优育检查的60例高危21-三体综合征胎儿孕妇作为研究对象,取所有孕妇的空腹肘静脉血进行PCR扩增血浆中游离胎儿DNA的方法构建研究,提取血浆中胎儿游离DNA,分别在76 ～ 83℃温度条件下对不同长度的DNA模板进行扩增,分别在76.6 ～ 86.6℃温度条件下对连接DNA进行整体扩增,分别在80 ～ 86.9℃温度条件下对整体扩增的影响,在81.4 ～ 86.9℃温度对整体扩增效率的影响.总结不同温度对cffDNA监测时PCR扩增的效果影响,根据上述结果构建扩增片段长度多态性(AFLP)方法检测cffDNA的方法.对60例孕妇cffDNA按照传统和新构建的AFLP方法对不同的模板进行扩增,比较两种ALFP对不同长度目的产物片段的整体效率并比较.分别进行60例孕妇中49例行羊膜腔穿刺取羊水行胎儿DNA检测,11例孕妇流产,孕妇流产过程中取羊水进行DNA检测.对60例孕妇cffDNA按照传统和新构建的AFLP方法分别进行21-三体综合征检测.以羊膜腔穿刺DNA检测和流产胎儿组织DNA检测结果为金标准,计算传统和新构建AFLP方法检测的cffDNA中21-单体综合征的敏感度、特异度、准确度.结果 79.9～82.4℃温度范围可有效提高＜300bp片段的cffDNA小片段扩增,而＞300bp片段扩增效果差,这一温度范围可有效分离母体DNA与胎儿游离DNA. 80.4℃-82.4℃可有效区分链接后cffDNA模板扩增图像,82.6℃-84.2℃变性温度可有效区分片段长度500bp目标片段,选择80-83℃扩增温度条件是适合cffDNA扩增效果的变性温度.新构建AFLP扩增法可有效提升产前诊断21-三体综合征的诊断特异度度和准确度.结论 在一定范围内降低PCR反应的变性温度能够引起cfDNA连接接头后整体扩增中大片段模板不能有效扩增,同时不影响小片段模板的扩增.可达到和有效区分母源性和胎源性DNA的效果,提升诊断的准确率,提升产前遗传优生指导正确性.

目的 运用荧光定量PCR(quantitative realtime PCR,Q-PCR)技术检测Rh D阴性孕妇血浆中游离胎儿DNA进行无创性产前诊断胎儿Rh D基因型.方法 通过微量DNA抽提技术,并利用琼脂糖凝胶电泳法富集孕妇血浆游离胎儿DNA(Cell-free fetal DNA,cff DNA),用Q-PCR技术检测43例Rh D阴性孕妇血浆cff DNA,测定不同孕期的孕妇全血和血浆中管家基因(β-actin)的含量,比较不同孕期孕妇全血和血浆DNA含量的变化;并用男性性别决定基因(sex-determining region Y gene,SYR)确定胎儿DNA的存在,以未有妊娠史的健康女性和健康男性作为阴性和阳性基因对照;同时对孕男胎的Rh D阴性孕妇血浆cff DNA进行Rh D基因外显子7、10和内含子4的特异性扩增,与孕妇产后采集的新生儿脐血Rh D定型结果 对比分析.结果(1)孕妇早、中期孕组血浆DNA含量差异无统计学意义(P>0.05),早、晚期和中、晚期孕组血浆DNA差异有统计学意义(P<0.05).(2)43例Rh D阴性孕妇中26例经产后证实为男胎,母血浆中检测到SYR基因特异性扩增的25例,灵敏度为96.15％,特异度为94.44％,准确率为97.67％.(3)26例孕男胎孕妇血浆中胎儿DNA的Rh D基因型检测发现,有19例胎儿Rh D血型阳性,5例胎儿Rh D血型阴性,即24例胎儿DNA的Rh D基因型与表型相符,准确率为97.6％.结论 运用Q-PCR技术检测Rh D阴性孕妇血浆中cff DNA进行无创性产前诊断胎儿Rh D基因型,是一种敏感性高、特异性好的无创性产前诊断方法,可用于临床诊断和预防新生儿Rh D溶血病.

目的 探讨无创产前检测(NIPT)联合孕妇血清可溶性转铁蛋白受体(sTfR)、生长分化因子(GDF)-15、红细胞体积分布宽度变异系数(RDW-CV)检测,对胎儿β-地中海贫血的诊断价值.方法 选择2017年1月至2018年6月,于自贡市妇幼保健院接受羊膜腔穿刺术确诊胎儿为β-地中海贫血的120例孕妇为研究对象.根据其妊娠胎儿的β-地中海贫血轻、中、重型,将其分别纳入轻型组(n=48)、中型组(n=40)与重型组(n=32).选取同期于本院建卡进行常规产前检查,并且妊娠胎儿发育正常的100例健康孕妇作为对照,纳入对照组.采集4组孕妇空腹肘静脉血,提取孕妇外周血浆中胎儿细胞外游离DNA(cfDNA),采用2次PCR方法扩增后,采用反向斑点杂交方法检测胎儿β-地中海贫血基因.采用酶联免疫吸附测定法,测定4组孕妇血清sTfR、GDF-15、RDW-CV水平.对4组孕妇血清sTfR、GDF-15与RDW-CV水平分别总体比较,采用单因素方差分析,进一步两两比较,采用最小显著性差异(LSD)-t检验.与胎儿β-地中海贫血诊断"金标准"比较,计算NIPT联合孕妇血清sTfR、GDF-15、RDW-CV水平及这4项指标单独检测,对于胎儿β-地中海贫血诊断的敏感度、特异度、粗符合率、阳性预测值、阴性预测值.本研究严格按照2013年修订的《世界医学协会赫尔辛基宣言》要求进行.4组孕妇年龄及其妊娠胎儿的胎龄等一般临床资料比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结果 ①夫妻双方β-地中海贫血基因型相同的40例孕妇中,NIPT与羊膜腔穿刺术对于胎儿β-地中海贫血诊断的符合率为90.0％(36/40);夫妻双方β-地中海贫血基因型不同的80例孕妇中,上述2种方法对于胎儿β-地中海贫血诊断的符合率亦为90.0％(72/80).②4组孕妇血清sTfR、GDF-15、RDW-CV水平分别总体比较,差异均有统计学意义(F=2283.445、323.181、45.900,P均<0.001),进一步两两比较,任意2组孕妇血清sTfR、GDF-15、RDW-CV水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05),并且孕妇血清sTfR、GDF-15、RDW-CV水平随着β-地中海贫血胎儿严重程度增加而逐渐升高.③NIPT联合孕妇血清sTfR、GDF-15、RDW-CV水平检测,对于胎儿β-地中海贫血诊断的敏感度、特异度、粗符合率、阳性预测值与阴性预测值,分别为86.7％、88.0％、87.3％、86.7％与84.6％,其特异度与阳性预测值,均显著高于单独检测孕妇血清sTfR、GDF-15、RDW-CV水平,并且差异均有统计学意义(与孕妇血清sTfR水平比较:χ2=8.866、5.301,P=0.003、0.021;与孕妇血清GDF-15水平比较:χ2=9.765、5.929,P=0.002、0.015;与孕妇血清RDW-CV水平比较:χ2=7.167、4.327,P=0.007、0.038).结论 孕妇血清sTfR、GDF-15、RDW-CV可能成为诊断胎儿β-地中海贫血的生物标志物,NIPT联合这3项指标检测,可提高诊断胎儿β-地中海贫血的特异度与阳性预测值.由于本研究纳入样本量相对较小,NIPT联合孕妇血清sTfR、GDF-15、RDW-CV水平,对胎儿β-地中海贫血的诊断价值,仍然有待进一步研究、证实.

目的 研究孕妇RhD基因对新生儿溶血病(HDN)的诊断价值.方法 纳入150例RhD阴性孕妇作为研究对象,采用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)法检测胎儿RhD血型基因型,并采用微柱凝胶抗人球蛋白试验检测孕妇血浆IgG抗-D抗体效价,记录检测结果,分析RhD基因型、IgG抗-D效价对诊断Rh-HDN的价值.结果 扩增试验结果显示有134例胎儿RhD基因外显子5、7和内含子4,为RhD阳性,与表型结果相比,其中3例假阳性,16例无外显子和内含子,为RhD阴性,与表型结果一致,基因型结果与表型结果一致性满意(Kappa = 0.903,P = 0.000).RhD阴性孕妇中,不规则抗体筛查阳性孕妇产前IgG抗-D不同效价的Rh-HDN发生率差异有统计学意义(x2 = 13.412,P=0.020).结论 RhD阴性孕妇中游离胎儿DNA基因型和抗体与HDN关系密切,产前行RhD基因型和抗D抗体检测有助于Rh-HDN诊断.