目的:建立指环病毒7型(TTV7)、8型(TTV8)、10型(TTV10)实时荧光定量PCR检测体系并进行临床验证。方法:本研究根据GenBank已发布的TTV7、TTV8、TTV10基因序列设计特异性引物，构建重组质粒pMD19-T-TTV7、pMD19-T-TTV8、pMD19-T-TTV10，以其作为阳性标准品建立了基于FAM-Eclipse探针法的实时荧光定量PCR检测，并进行特异性、敏感性试验与临床样本检测。结果:TTV7、TTV8、TTV10的实时荧光定量PCR检测体系标准曲线方程分别为 y＝-0.340 2 x+114.780 0、 y＝-0.351 1 x+114.940 0、 y＝-0.348 9 x+115.020 0，相关系数都在0.99以上，与其他病毒无交叉反应，检测敏感性分别为108拷贝/μl、84拷贝/μl、98拷贝/μl。在临床小儿血清样本中的检测阳性率分别为10.9%、2.1%和4.3%。 结论:本研究建立的TTV7、TTV8、TTV10实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏性高等特点，可为临床血清样本TTV检测提供一个快速手段。

目的 了解健康人群和丙型肝炎病毒(HCV)-RNA阳性患者血清标本中病毒群落的组成;比较健康组与 HCV感染组血清标本中病毒群落组的差异性;挖掘新型HCV及其他新病毒.方法 提取血浆样品中的全部核酸,反转录后采用Illumina index primers进行扩增构建病毒文库,随后进行Miseq深度测序,通过生物信息学分析筛选出与病毒相关的序列.结果 HCV01文库中总病毒序列数为1 514条,主要由黄病毒科(48％)、指环病毒科(29％)、反转录病毒科(7％)、微小噬菌体科(2％)构成;HCV02文库中总病毒序列数为2 820条,主要由指环病毒科(61％)、黄病毒科(18％)、反转录病毒科(8％)、微小噬菌体科(1％)构成;HCV03文库中总病毒序列数为3 534条,主要由指环病毒科(78％)、黄病毒科(4％)、反转录病毒科(4％)、人类内源性反转录病毒科(2％)、微小噬菌体科(1％)构成;HCV04文库中总病毒序列数为3 549条,主要由指环病毒科(90％)、反转录病毒科(2％)构成.结论 血液中存在多种病毒,HCV感染患者血液中主要存在指环病毒科、黄病毒科、反转录病毒科病毒,而健康人群血液中主要为指环病毒科、反转录病毒科病毒;血清中 HCV水平可能对指环病毒科病毒的复制有抑制作用,即HCV水平越高则指环病毒科病毒水平越低.

目的 建立指环病毒(Torque teno virus,TTV)6实时荧光定量PCR检测体系,并验证检测体系的敏感性与特异性.方法 根据GenBank中登录的TTV6基因序列设计引物与FAM-Eclipse探针,建立基于FAM-Eclipse探针法的实时荧光定量PCR检测方法,建立标准曲线并进行敏感性与特异性分析.结果 建立了能够特异检测TTV6的荧光定量PCR检测方法,标准曲线方程为y=-3.0921x+28.36,扩增效率和R2分别为99.6％和1.000.该方法检测TTV6的敏感度为1.0× 10拷贝/μl,与其他病毒无交叉反应.在临床呼吸道感染人群56份咽拭子样本中检出1例TTV6阳性.结论 基于FAM-Eclipse探针建立的检测TTV6实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强与灵敏度高等优点,可为临床上TTV6的检出与定量病毒含量提供了一种有效的手段.

目的 利用高通量宏基因组测序技术对血液病患者感染性病原体进行横断面调查,为此类感染性疾病高危患者的快速诊断及早期针对性用药提供依据.方法 回顾性分析2019年1月至6月华中科技大学同济医学院附属同济医院血液科血液病患者外周血临床标本高通量宏基因组分析数据及患者临床特征,并归纳血液病患者的感染病原体种类特征.结果 共纳入41例患者资料,检出病原体阳性患者24例,其中细菌感染以假单胞菌属感染比例最高(4/24、16.67％),其次为不动杆菌属(2/24、8.33％)、克雷伯菌属(2/24、8.33％)、葡萄球菌属(2/24、8.33％)和黄单胞杆菌属(2/24、8.33％);而奈瑟菌属、米勒菌属、幽门螺杆菌以及结核分枝杆菌则较罕见.共有6例患者检出混合型感染,其中以病毒和细菌混合型感染最为多见(4/24、16.67％).真菌感染的病原菌种类较细菌性病原体更为分散,白色念珠菌、青霉菌、肺孢子菌和根霉菌检出1例(占0.04％),无明显聚集性;病原体相对丰度方面,83.33％(5/6)真菌病原体阳性患者的检出序列片段数偏少(<100),仅1例检出高负荷真菌感染(曲霉菌序列片段数为2836).病毒类病原体的检测结果显示,病毒筛查谱限于已知的常见DNA病毒;从测序结果看,24例检测阳性患者中巨细胞病毒、EB病毒和单纯疱疹病毒1型为检出率最高的病毒,均占20.83％(5/24);较真菌,病毒种类存在一定聚集性,其相对负荷亦较高(平均序列片段数>200);而单纯疱疹病毒2型和指环病毒属病毒检出率相对较低,分别占4.17％(1/24)和8.33％(2/24).结论 本研究创新性地利用高通量宏基因组测序技术检测血液病患者感染性疾病的病原体谱系;利用高通量宏基因组测序技术可快速锁定病原体并予以针对性抗菌药物治疗具有重要的临床价值.

目的:分析不明原因发热患者肺泡灌洗液中的病毒谱.方法:将58例肺泡灌洗液样本随机分为5组分别构建5个文库,利用病毒宏基因组学技术进行病毒群落分析,并对获得的细环病毒及鼻病毒进行阳性样本筛选.结果:肺泡灌洗液病毒群落组成中,指环病毒科占主体地位(19.4％),其次为圆环病毒科(11.0％),藻去氧核糖核酸病毒科(11.0％),人类内源性递转录病毒科(10.2％),痘病毒科(4.9％),逆转录病毒科(3.2％),帚状病毒科(2.3％),小RNA病毒科(0.6％);并发现了4株序列较长的细环病毒,根据细环病毒开放阅读框1进行系统进化分析,显示其与已知的细环病毒在核酸水平上有一定的差异.通过对细环病毒及鼻病毒阳性样本的筛选,发现细环病毒阳性率为11.3％,鼻病毒阳性率为10.0％.结论:应用病毒宏基因组学技术成功解析出不明原因发热患者肺泡灌洗液中的病毒群落组成,病毒群落中指环病毒科占比最高,其中细环病毒因发热导致的炎性环境以及患者免疫力低下而大量增殖.

目的 通过病毒宏基因组学分析镇江地区上呼吸道病毒感染患儿鼻腔病毒谱构成.方法 收集100份呼吸道疾病患儿鼻黏膜分泌物样本,提取核酸,采用高通量测序平台进行测序,通过病毒宏基因组学分析平台分析病毒谱.结果 镇江地区上呼吸道病毒感染患儿鼻腔微环境内病毒群落主要由腺病毒科(30.13％)、小RNA病毒科(24.04％)、冠状病毒科(11.22％)、指环病毒科(10.58％)、多瘤病毒科(10.58％)和副黏液病毒科(7.37％)等组成.所检测文库病毒主要为腺病毒科(30.13％)和小RNA病毒科(24.04％).结论 镇江地区上呼吸道病毒感染患儿鼻腔内病毒类型较为丰富,主要为腺病毒科和小RNA病毒科.上呼吸道病毒感染患儿鼻腔病毒谱的初步筛查,可为儿童病毒性上呼吸道感染的预防及临床治疗提供实验室依据.

病毒是儿童脑(膜)炎发病的重要病原体,为全面了解脑(膜)炎儿童脑脊液中的病毒感染情况,采集2019年6月-2019年9月复旦大学附属儿科医院26例病毒性脑(膜)炎(Viral encephalitis and meningitis,VEVM)儿童脑脊液标本,通过两种核酸检测方法进行病毒检测.病毒宏基因组测序检测到小RNA病毒科(Picornaviridae,82.42％)、浓病毒亚科(Densovirinae,9.07％)、指环病毒科(Anelloviridae,3.21％)、圆环病毒科(Circoviridae,0.85％)、星状病毒科(Astroviridae,0.76％)和小双节 RNA 病毒科(Picobirnaviridae,0.38％),通过聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测到肠道病毒(Enterovirus,EV)、单纯疱疹病毒 1 型(Herpes simplex virus,HSV-1)、人单纯疱疹病毒4型(Epstein-Barr virus,EBV)及腮腺炎病毒(Mumps virus,MuV),检出率分别为42.31％、7.69％﹑7.69％和3.85％.本研究初步明确了26例VEVM儿童脑脊液病毒信息,为深入研究其病原学进化分析奠定了基础.