目的 克隆猪苓Polyporus umbellatus菌核无机磷酸盐转运蛋白基因并进行生物信息学和表达模式分析.方法 采用RT-PCR技术从猪苓菌核中克隆得到1个无机磷酸盐转运蛋白(inorganic phosphate transporter)基因,利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域、信号肽和跨膜结构等分子特性;采用Clustal W2以及MEGA 6.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;实时荧光定量PCR分析基因表达模式.结果 猪苓无机磷酸盐转运蛋白基因命名为PuPiT (NCBI登录号:KU179154).该基因开放读码框全长为1 590 bp,编码530个氨基酸.PuPiT蛋白相对分子质量为57 552,等电点6.82.氨基酸序列分析表明,PuPiT蛋白具有12个跨膜区.氨基酸序列多重比对及系统发育树结果显示PuPiT与Moniliophthora rorer亲缘关系最近,与Moniliophthora roreri、双色蜡蘑Laccaria bicolor、Heterobasidion irregulare有较高的同源性,荧光定量PCR结果表明,PuPiT在与蜜环菌共生的猪苓菌核及未与蜜环菌共生的菌核中都有表达,其中共生部分的表达量显著上调,约是未共生部位的12倍,说明其参与猪苓与蜜环菌共生过程.结论 PuPiT基因克隆和分子特征为进一步研究揭示其在猪苓菌核磷元素转运及与蜜环菌共生过程中的调控作用奠定基础.

无机磷酸盐(Pi)在菌体遗传、能量代谢及细胞内的信号传导等生物过程中发挥重要的作用.在细菌中,主要由磷酸盐特殊转运系统(Pst)和磷酸盐转运系统(Pit)来完成对Pi的吸收和利用.其中,Pst是在低磷胁迫下转运Pi的关键系统.近年来的研究表明,Pst系统除在调控Pi的代谢和平衡中发挥重要作用外,还介导细菌耐药、产毒和侵袭等.Pst系统是ABC转运蛋白家族的一种,一般由PstS、PstC、PstA、PstB和PhoU 5个蛋白组成.其中,PstS和PstB蛋白是该系统中的关键蛋白.本文重点对PstS和PstB调控Pi转运和介导细菌耐药的分子机制进行综述,旨在为深入研究该系统与细菌耐药的关系,以及研发以PstS和PstB为靶点的新药提供参考.

[目的]克隆红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)无机磷酸盐转运蛋白(Inorganic phosphate transporter,PHO88)基因,构建原核表达质粒,并对PHO88蛋白进行生物信息学分析.[方法]根据GenBank公布的T.rubrum CBS 118892菌株pho88基因序列(XP-003235348),设计合成特异性引物,提取红色毛癣菌总RNA,反转录为cDNA,PCR扩增pho88基因,构建到原核表达载体pET-28a上,测序鉴定其序列,并对其进行生物信息学分析.[结果]红色毛癣菌pho88基因全长582 bp,编码193个氨基酸.PHO88蛋白含有1个跨膜结构域,细胞亚定位为分泌信号途径蛋白,PHO88含有16个磷酸化修饰位点,其二级结构主要由α-螺旋构成,高级结构为全α型蛋白质.[结论]成功克隆红色毛癣菌pho88基因及构建原核表达质粒,为后续PHO88蛋白的诱导表达奠定基础,为后续开发靶向PHO88的抗真菌药物,提供实验基础.

作为生物体必需的营养元素之一,磷在物质代谢、信号传导和能量储存中起着关键作用.[目的]研究丝状真菌Podospora anserina中调控磷酸盐代谢相关转录因子的作用,可进一步阐明真核微生物中磷元素吸收的调控机制.[方法]利用同源重组的方法定点敲除P.anserina中2个磷代谢相关转录因子PaPho1和PaPho2,遗传杂交构建双重突变体△PaPho1△PaPho2;通过表型分析、无机磷含量测定和酸性磷酸酶活性测定分析各突变菌株的变化;利用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)分析磷代谢相关基因的表达情况.[结果]在无机磷作为唯一磷来源的培养基上,△PaPho1△PaPho2无法生长;在添加有机磷的培养基中,△PaPho1△PaPho2和野生型菌株生长无显著性差异.在同时添加有机磷和无机磷的培养基中,△PaPho1△PaPho2的无机磷含量和酸性磷酸酶活性比野生型菌株的分别下降了 25.0％和61.9％,△PaPho1△PaPho2中无机磷酸盐转运蛋白基因的表达水平显著降低.[结论]在P.anserina中,PaPho1和PaPho2作为调控磷酸盐代谢信号通路转录因子,对无机磷的吸收起到关键作用,但并不参与有机磷的代谢调控.该研究可为阐释丝状真菌P.anserina对无机磷吸收的调控机制提供参考.

磷酸盐(Pi)稳态在所有生物体中都是一个受严格调控的过程,其功能障碍会导致人类肾范科尼综合征(Fanconi syndrome)、植物生长迟缓和微生物致死等多种功能紊乱.为了在Pi的生物合成需求和胞质Pi浓度过高的风险之间实现平衡,细胞以无机多聚磷酸盐(polyP)的形式将Pi储存在膜结合的酸钙小体样细胞器中.酿酒酵母液泡转运蛋白伴侣(vacuolar transporter chaperone,VTC)复合体作为已知的真核生物多聚磷酸盐聚合酶,利用ATP在胞质中合成polyP,并将其转运到液泡中储存起来以维持细胞内Pi稳态.本文从结构特征、polyP合成及polyP转运机制等方面介绍了VTC复合体结构和功能的最新研究进展,着重介绍了最近发表的完整VTC复合体的结构信息,并探讨了VTC的激活机制.