猪苓菌核栽培中种苓质量不稳定是影响猪苓菌核品质和产量的关键问题,该文拟对根癌农杆菌介导的猪苓遗传转化体系进行研究,为通过分子育种从而获得优质种苓提供技术保障.采用根癌农杆菌介导法探究抗生素浓度、菌株类型、菌液浓度、受体材料、侵染时间、共培养时间和筛选条件对猪苓遗传转化效率的影响,利用潮霉素抗性标记基因、特异引物PCR以及荧光检测方法筛选并检测转化子.结果表明,根癌农杆菌GV3101菌株可对猪苓菌丝进行遗传转化,菌液浓度A600nm=0.6,受体材料猪苓菌丝,侵染30 min,共培养3 d为最佳侵染条件;9 μg·mL-1潮霉素初筛和13 μg·mL-1潮霉素复筛两步筛选法为最优筛选条件.经潮霉素抗性筛选、特异引物PCR检测和荧光检测分析,结果表明外源基因eGFP已转入猪苓菌丝内整合到基因组中并成功表达,在最优条件下,转化率可达到2.3％,遗传转化周期从大于90 d缩短到小于60 d.该研究建立并优化了根癌农杆菌介导的猪苓菌丝遗传转化体系,为解析猪苓生长发育的分子机制及分子育种奠定基础.

猪苓与蜜环菌建立共生关系时,猪苓菌丝会反侵染并消解蜜环菌菌索,以获取营养物质,糖苷水解酶是参与这一过程的主要酶类之一.本研究从猪苓转录数据库中获得糖苷水解酶家族基因42 类、309 个;其编码的糖苷水解酶蛋白含各类结构域 344 个,以糖苷水解酶结构域 glyco_hydro为主,共计 35 类 173 个.对猪苓糖苷水解酶进行的gene ontology(GO)功能注释结果表明,这些蛋白参与的生物学过程以物质代谢及分解过程为主,特别是多糖等大分子物质代谢;181 个猪苓糖苷水解酶具有水解酶活性,这些水解酶活性呈多样性分布.与未被蜜环菌侵染的猪苓部位相比,43 个糖苷水解酶基因在蜜环菌侵染的菌核部位中差异表达,编码包括 glyco_hydro_48、cellulase 和polysacc_deac_1 等功能结构域,可能发挥水解几丁质、纤维素酶活性及免疫调节等活性,这为猪苓与蜜环菌互作关系的研究提供了候选基因及蛋白.

目的 克隆猪苓Polyporus umbellatus菌核无机磷酸盐转运蛋白基因并进行生物信息学和表达模式分析.方法 采用RT-PCR技术从猪苓菌核中克隆得到1个无机磷酸盐转运蛋白(inorganic phosphate transporter)基因,利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域、信号肽和跨膜结构等分子特性;采用Clustal W2以及MEGA 6.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;实时荧光定量PCR分析基因表达模式.结果 猪苓无机磷酸盐转运蛋白基因命名为PuPiT (NCBI登录号:KU179154).该基因开放读码框全长为1 590 bp,编码530个氨基酸.PuPiT蛋白相对分子质量为57 552,等电点6.82.氨基酸序列分析表明,PuPiT蛋白具有12个跨膜区.氨基酸序列多重比对及系统发育树结果显示PuPiT与Moniliophthora rorer亲缘关系最近,与Moniliophthora roreri、双色蜡蘑Laccaria bicolor、Heterobasidion irregulare有较高的同源性,荧光定量PCR结果表明,PuPiT在与蜜环菌共生的猪苓菌核及未与蜜环菌共生的菌核中都有表达,其中共生部分的表达量显著上调,约是未共生部位的12倍,说明其参与猪苓与蜜环菌共生过程.结论 PuPiT基因克隆和分子特征为进一步研究揭示其在猪苓菌核磷元素转运及与蜜环菌共生过程中的调控作用奠定基础.

蜜环菌能为药用真菌伞形多孔菌菌核(猪苓)的生长提供营养,其自身也是一种重要的食药用真菌.筛选优良的蜜环菌菌株既可用于猪苓的栽培生产,也可为蜜环菌的进一步开发提供参考.本研究将从野生猪苓中分离得到的47株蜜环菌菌株划分形态型,选取12个代表性菌株进行液体培养,研究菌丝体多糖含量,以及发酵液中的羧甲基纤维素酶(CMC酶)、木聚糖酶、漆酶的活性变化.结果显示,蜜环菌菌株M8-3生长较快,生物量累积最高,3种关键酶的活性也较高,为较优质菌株,可用于猪苓的栽培实验;菌株M3和M8-3菌丝体多糖含量较高,可作为蜜环菌开发利用的候选菌株.

蜜环菌是名贵中药天麻、猪苓栽培过程中必备的共生菌,蜜环菌的菌索侵入天麻块茎或猪苓菌核后被后者消化利用,成为它们重要的营养源.不同性质的蜜环菌影响天麻、猪苓的生长.作者收集了13个地区的市售蜜环菌,经过IGS鉴定均为高卢蜜环菌.在基因水平和代谢水平上筛选出了蔗糖含量具有显著差异的2种高卢蜜环菌,命名为A型和B型,并建立了简单、准确的高卢蜜环菌DNA分子标记鉴定方法.通过比较高卢蜜环菌A型和B型蔗糖酶基因序列差异,根据差异片段设计聚合酶链反应-限制性内切酶酶切长度多态(PCR-RFLP)鉴别方法,即引物ZTM.F/ZTM.R可扩增高卢蜜环菌A型和B型,产生约304 bp长度条带,限制性内切酶EcoRV可以识别高卢蜜环菌A型和B型的差异序列,仅高卢蜜环菌B型可以被酶切形成2个片段,从而特异性鉴别高卢蜜环菌为B型.该实验建立的PCR-RFLP可以作为高卢蜜环菌A型和B型的DNA鉴别方法.在天麻和猪苓的栽培过程中,可根据品种、生长阶段、生态环境等不同需要,选择合适的菌株,因地制宜提升它们的产量和品质.

药用真菌猪苓菌核的发育代谢过程一直备受关注.为了解猪苓菌核的发育历程,该研究对3个不同时期的猪苓菌核进行了转录组学分析,共得到88.12 Gb测序数据,包含85 235条unigene.对差异基因进行深度挖掘,筛选了有关跨膜运输、防御、极性生长、形态发育、黑色素合成、细胞壁合成、药效成分麦角甾醇和猪苓多糖合成功能的DEGs,从而推测了菌核发育的分子机制.根据DEGs的通路富集注释结果和相关报道,进一步推测猪苓菌核的发育是由于非生物胁迫(温差和缺氧)和生物胁迫(共生菌蜜环菌和伴生菌的入侵)诱导所致,造成菌核的氧化应激状态,加速合成膜转运蛋白和麦角甾醇从而实现物质的跨膜运输和转换,并通过WD40蛋白实现自身的防御机制.小GTPase和细胞色素P450响应环境信号,进而调控细胞的极性生长和形态发生,期间表皮黑色素沉积,细胞壁加厚,猪苓多糖合成,最终使得猪苓菌核的发育成熟.猪苓菌核不同时期转录组的研究为今后解析其发育历程和相关代谢过程的分子机制奠定了坚实的基础.

目的:优选茯苓立方块产地加工工艺参数,为茯苓产地加工与炮制一体化工艺提供科学依据.方法:根据市售茯苓饮片质量分析及对茯苓加工方式跟踪调研结果,采用单因素试验考察茯苓药材不同加工方式中去皮、发汗、切制、干燥等加工环节.采用正交试验对加工工艺中蒸制时间、切制规格和干燥温度3个因素进行考察,以茯苓多糖、茯苓总三萜、猪苓酸C、去氢茯苓酸、茯苓酸含量为评价指标,结合饮片的外观性状及成型率,采用综合评分法优选工艺条件;经中试试验修正,确定产地加工与炮制一体化工艺技术参数.结果:新鲜茯苓菌核,蒸制90 min,削去外皮,切制成厚度为8mm的立方块,通风阴晾2d后,烘房中50℃烘干,样品符合《中华人民共和国药典》2015年版要求.结论:该工艺切实可行,适合茯苓立方块的产业化加工.

通过查阅本草古籍、医典方书和现代文献,考证经典名方中猪苓的名称、产地、品质、基原、采收、炮制、性味归经和功效主治.猪苓之名源于其形似猪粪的形态特点,其别名多与形态特点、生长习性或方音讹传有关.古代猪苓以野生为主,多产自南方;至近现代才出现人工培育的记载,产地亦遍布陕西、河南、河北、四川、云南等省,其中陕西、云南产量较大,以陕西质量最佳.古代猪苓采收以春秋两季为主,与《中华人民共和国药典》的记载一致.猪苓的品质鉴定与炮制古今较为统一,均以皮黑肉白,坚实者佳,采后祛杂质,除黑皮,切片,阴干后保存.现今我国各地猪苓均为多孔菌属真菌猪苓[Polyporus umbellatus(Pers.)Fr.]的干燥菌核.金元前记载其性味为"甘、苦,平,无毒",以后的历代本草和《中华人民共和国药典》多认为其性味为"甘、淡,平,无毒",归"肾、膀胱"经.宋代及以前记载猪苓"治痎疟,解毒,蛊注不祥,利水道,久服轻身耐老",宋代以后医家注意到猪苓的淡渗利湿之效强而补益之效弱,主要将其用于消肿满、除湿通淋、利小便.现代本草和文献则多聚焦于猪苓利水渗湿的功效.