由致病疫霉(Phytophthora infestans(Mont.)de Bary)引起的晚疫病是马铃薯生产中最具毁灭性的病害.为了成功入侵和在寄主植物中繁衍,致病疫霉会向寄主细胞分泌一类RXLR效应蛋白以干扰植物免疫系统.自2005年克隆第一个晚疫病菌RXLR类无毒基因AVR3a以来,国内外学者从RXLR效应蛋白的结构、功能,以及与寄主靶标作用机理等多个方面展开了大量研究.随着高通量测序技术与效应子组学技术的发展,RXLR效应蛋白抑制植物免疫分子机制也取得了显著进展.RXLR效应蛋白的研究有助于揭示致病疫霉与马铃薯互作分子机制,并进一步为马铃薯抗病育种工作提供新思路.主要概述了致病疫霉RXLR效应蛋白的相关研究进展,重点介绍了致病疫霉AVR基因的克隆、定位、变异及功能等方面的最新进展,同时对未来值得关注的研究方向进行了探讨.

为明确致病疫霉的致病机理需要建立高效的病原菌原生质体制备和再生体系.通过对马铃薯晚疫病菌制备和再生过程的研究,采用两种裂解酶Driselase和Cellulase R-10,以不同菌龄、裂解酶、裂解酶的浓度和裂解酶的反应时间为研究条件,得到原生质体制备的最佳条件为:以培养18 d的菌丝体为材料,用10 mg/mL Driselase处理菌丝60 min后,原生质体产量达9.5×104个/g;以0.1 mol/L氯化钙和0.4 mol/L甘露醇作为渗透压稳定剂,以黑麦V8固体再生培养基得到的原生质体再生率最高达3.1％.

[背景]Pseudomonas最突出的植物促生性状是可抑制植物病原微生物,但其它植物促生性状报道相对较少.[目的]明确Pseudomonas sp.BP16的植物促生性状,揭示其对小麦幼苗和马铃薯的促生效应,以期为该菌株的田间应用提供理论依据.[方法]基于无机磷培养基,以涂布划线技术进行分离纯化;通过多相分类对BP16进行分类鉴定;以选择性培养基或比色法等方法对促生性状进行定性或定量分析;设置3种处理pBP16、VK、CK,分别代表施加含BP16的颗粒微生物肥料、施加不合菌的空载体颗粒、颗粒微生物肥料和空载体颗粒都不施加的空白处理,采用盆栽试验分析不同处理下的小麦和马铃薯生长性状及其根围土理化性质的变化.[结果]共分离得到41株菌;1株编号为BP16菌株的16S rRNA基因序列与P.brassicacearum subsp,neoaurantiaca的相似性最高(99.38％),但一些生理生化特征如明胶液化存在一定的差异;BP16菌株的解磷酸钙-磷能力最强,其发酵液中水溶性磷含量可达67.15μg/mL菌液,而且该菌具有固氮能力、产IAA (Indole-3-acetic acid)能力(8.93 mg/L)、产铁载体能力(D/d为2.46)、ACC脱氨酶活性,同时能够抑制植物病原菌马铃薯晚疫病病原菌、亚麻枯萎病病原菌和向日葵菌核病病原菌,其抑菌率分别为76.19％、32.00％和22.22％;pBP16相比VK和CK处理,显著提高了小麦的株高、根长、叶绿素含量以及干重(提高约5.29％-90.90％),根围土速效磷和速效氮含量也显著提高,提高约8.63％-83.81％;同时,pBP 16较VK和CK处理的单株产量以及根围土速效磷都有极显著的提高,而速效氮水平高于CK.[结论]菌株BP16为P.brassicacearum的一个新亚种,具有多种植物促生性状,对植物促生效应良好,可作为植物促生菌剂用菌种、具有良好的应用前景.

泛素结合酶(Ubiquitin-conjugating Enzyme E2,UBC)与植物生长发育和抗病反应密切相关.为了解泛素结合酶基因对植物抗晚疫病的贡献,从马铃薯栽培种"合作88"中克隆出一个E2泛素结合酶基因,命名为StUBC17,并对其受晚疫病菌诱导表达特性及功能进行分析.利用病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术降低本氏烟(Nicotiana benthamiana)中StUBC17同源基因(NbUBC)的转录水平,再接种晚疫病菌进行抗病性鉴定.进一步在基因沉默植株上瞬时表达马铃薯抗病基因和其相应的无毒基因(R3a+AVR3a、R3b+AVR3b和Rx+CP)及INF1.StUBC17编码区全长447 bp,编码148个氨基酸,其蛋白分子量为16.52 kD,理论等电点为7.72.表达分析结果表明,StUBC17受晚疫病菌诱导表达.抗病鉴定结果显示,与对照植株相比,NbUBC沉默植株的抗病性显著降低.沉默NbUBC不影响过敏反应(Hypersensitive responses,HR)的发生.StUBC17是植物防御晚疫病所需,但该基因的沉默并不影响R3a、R3b、Rx及INF1介导的HR反应.

致病疫霉Phytophthora infestans为马铃薯晚疫病的重要病原菌.通过从昆明市寻甸县采集110P和H-6两株致病疫霉,明确其染色体倍性、交配型、线粒体单倍型、毒性和甲霜灵敏感性,经对峙培养,利用改良的卵孢子萌发方法获得有性生殖F1代群体POP1(60株),并对POP1进行表型和基因型测定.结果 表明:冷冻处理24h为最佳条件,卵孢子萌发率达5.09％+0.15％;POP1的交配型、毒性和甲霜灵敏感性均发生了分离,其中交配型分离比为A1∶A2∶A1A2∶自育型(SF) =16∶5∶17∶22,毒性分离比为抗性(R)∶敏感性(S) =11∶49,甲霜灵敏感性分离比为抗性(R)∶敏感性(S)=2∶58;3个表型的分离均偏离孟德尔单基因显性遗传特点.基于8对SSR多态性引物对POP1基因型分析表明,遗传相似系数为0.98时,可将所有菌株分为14个基因型;遗传相似系数为0.95时,可将POP1分为6个分支,其中优势群体为S1,占分离群体的61.67％.关联分析进一步表明,8对SSR所代表的基因型和几个重要表型有显著相关性(R2=0.6667).本研究建立了高效的致病疫霉卵孢子萌发体系,解析了有性生殖后代群体遗传结构特点,为深入探索致病疫霉的变异规律及病害流行趋势提供了理论基础.

植物SWEET基因家族是一类糖转运蛋白,在植物的生理活动和生长发育过程中发挥着重要功能.为了解马铃薯SWEET基因的相关信息,探究其在马铃薯不同组织以及在生物胁迫与非生物胁迫下的表达特性.该研究采用同源克隆技术从马铃薯‘青薯9号’中克隆了StSWEET5基因(GenBank登录号为MN295671),其CDS序列长度为717 bp,编码238个氨基酸.系统进化树分析结果表明,StSWEET5与番茄的氨基酸序列相似性最高(97.06％).qRT-PCR分析表明:StSWEET5基因在马铃薯各组织(根、茎、叶、花、块茎、匍匐茎)中均有表达,且在花中的表达显著高于其他组织;糖胁迫下,StSWEET5基因在根、茎、叶中均有表达,尤其在根中的表达差异最为显著(P＜0.05).在晚疫病菌(Ph ytophthora in estans)诱导后36 h时,表达量达到最高,随后急剧下调.推测StSWEET5基因参与了马铃薯糖胁迫以及响应了晚疫病诱导的过程.

马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)属卵菌纲(Oomycetes)霜霉目(eronosporales)腐霉科(Pythiaceae)疫霉属(Phytoph thora),是马铃薯和番茄晚疫病病原菌.由于晚疫病对马铃薯生产的毁灭性和严重性,对致病疫霉的研究一直是关注的重点.本文首先对病害引起的症状、发生特点及流行规律进行阐述,对有性生殖发生的遗传规律和多种交配型共存的大环境下病原菌群体结构变异特点进行归纳总结.随着2009年致病疫霉基因组测序的完成,本文比对了疫霉属目前已完成测序各个种的基因组学特点,介绍了致病疫霉在效应子克隆方面的研究进展及线粒体基因组研究现状,阐述了功能基因组学的两个重要技术:高密度遗传连锁图谱(high density linkage mapping)和全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS),及其在挖掘致病疫霉重要功能基因上的应用.本文有助于了解致病疫霉研究热点及后续突破方向,可为深入解析致病疫霉的功能基因及致病机制提供参考,对开发马铃薯晚疫病菌药物靶标及预测病害的大规模流行趋势也具有重要意义.

[背景]粘细菌是一类具有社会性行为的高等原核生物,能产生丰富、多样、新颖的具有生物活性的次级代谢产物,具有很大的研究开发价值.[目的]从土壤样品中筛选出对致病疫-(Phytophthora infestans)具有拮抗作用的粘细菌,并对其次级代谢产物进行研究.[方法]对分离到的一株拮抗P.infestans菌株,结合形态观察和16S rRNA基因序列分析确定其分类地位,并通过单因素分析与正交优化相结合的方法对菌株的发酵参数进行研究.采用滤纸片法对其浓缩发酵液中活性物质的稳定性及抗菌活性进行检测,并通过薄层色谱法(thin layer chromatography,TLC)与高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)等初步分离后,将具有抗P.infestans活性的组分利用液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)进行检测,最后通过离体叶片法测定活性物质对马铃薯晚疫病的防病作用.[结果]从土壤样品中分离得到的菌株B25-Ⅰ-3对P.infestans表现出较强的拮抗活性,经鉴定为橙色粘球菌(Myxococcus fulvus).其拮抗P.infestans的活性物质主要存在于胞外,产活性物质的最优发酵条件为:摇床转速180 r/min,接种量10％,培养温度30℃,发酵周期7d.该菌株产生的活性物质耐受蛋白酶K以及紫外线与自然光照射,对温度耐受性极强,而且易于在低温下保存,对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、向日葵核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)均有不同程度的抑制作用.其对P.infestans的拮抗组分中含有N-(3-氨基-2-羟丙基)-N-甲基硫酸二酰胺[N-(3-amino-2-hydroxypropyl)-N-methylsulfuric diamide]与甲基(2R)-2-叠氮基-3-羟基-2-甲基丙酸酯[methyl(2R)-2-azido-3-hydroxyl-2-methylpropanoate],该活性物质能明显抑制P.infestans侵染马铃薯叶片且对不同品种的叶片均无损伤作用.[结论]研究为M.fulvus B25-Ⅰ-3活性物质的分离鉴定及抗马铃薯晚疫病生物农药的研发提供了基础数据.

本研究从药用植物马比木Nothapodytes pittosporoides的花瓣中分离获得了1株真菌,经形态学与ITS分子共同鉴定为砖红镰刀菌Fusarium lateritium.使用该菌处理马铃薯后发现,显著增强了马铃薯对晚疫病菌的耐受性,处理组植株感染率为37.5％,相较对照组87.5％的感染率显著降低;植株生长测定发现,处理组的马铃薯生物量、株高、根系生物量和主根数相较于对照组分别提高了1.25、1.19、2.3、1.47倍,表明该真菌对马铃薯还具有促生作用.为探究砖红镰刀菌促生抗病的分子机理,检测了植物生长素合成和免疫防御相关基因的表达模式,结果表明处理组植株生长素合成相关基因(StYUC5)显著上调,而免疫相关激素茉莉酸和水杨酸合成相关基因(StPl-I、StPAL和StPR1A)也不同程度上调.由此推测,砖红镰刀菌通过调控植物激素相关基因的表达介导马铃薯的促生和抗病.为了进一步探究砖红镰刀菌对马铃薯促生抗病的分子基础,构建了其遗传转化体系,并进行了优化,获得了GFP标记菌株.

背景:番茄(Solanum lycopersicum)是广泛种植的最具价值的果蔬之一,番茄晚疫病会导致其产量和品质降低.microRNAs (miRNAs)是一类内源性非编码RNA,广泛参与基因转录后调控.已有研究表明miR399家族可参与调控植物抗病过程.目的:探究番茄miR399(sly-miR399)对番茄抗晚疫病的影响.方法:构建sly-miR399的过表达和沉默载体,利用农杆菌介导在番茄叶片中瞬时表达;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测相关基因表达水平;台盼蓝染色并统计分析瞬时过表达和瞬时沉默sly-miR399的番茄叶片的病斑情况.结果:瞬时过表达sly-miR399导致其靶基因UBC24的表达量下降了75％,病程相关蛋白(pathogenesis related proteins,PRs) SlPR1、SlPR2、SlPR3和SlPR5的表达量分别上升了3.6倍、2.2倍、2.3倍和6.4倍,茉莉酸(JA)信号通路相关基因SlJAl、SlLOX1和SlLOX2的表达量分别上升了1.3倍、2.5倍和1.5倍,JA转录抑制因子SlJAZ1的表达量下降了50％,接种晚疫病菌后,叶片上相对病斑面积明显减小;瞬时沉默导致其靶基因的表达量上升了1.8倍,PRs基因的表达量分别下降了65％、82％、52％和80％,SlJA1、SlLOX1和SlLOX2的表达量分别下降了84％、50％和65％,SlJAZ1的表达量上升了1.8倍,病菌接种后叶片上相对病斑面积明显变大.结论:初步揭示了sly-miR399在番茄抗晚疫病过程中的正调控因子作用.