[目的]水稻的抽穗期对水稻地域适应性及水稻产量至关重要,对水稻抽穗期基因进行鉴定及功能分析,可以为水稻育种提供优异的基因资源.[方法]通过BSA-seq方法对一个黄化早抽穗突变体hz1(huangzao 1)进行基因定位克隆及连锁分析;利用RT-qPCR技术分析目的基因HZ1 的表达谱,并用水稻原生质体瞬时转化查明HZ1 的亚细胞定位;对突变体的抽穗期、叶绿素含量、过氧化氢含量等生理指标进行测定,详细分析其表型变化.[结果]田间表型观察发现hz1表现早抽穗,长日照(long-day,LD)及短日照(short-day,SD)条件下hz1 的抽穗期相同,分别比野生型(wild type,WT)早抽穗 43 d和 26 d,表明hz1 是一个光周期不敏感的突变体.同时hz1 表现黄化表型,相比WT,叶绿素含量下降.遗传分析表明hz1 由隐性单基因控制,F2 混池高通量测序将目的基因定位于水稻第 6 染色体上 17.8 Mb区间内,分析发现该区间内一个T-DNA插入位点LOC_Os06g40080 与hz1 目标性状完全连锁,LOC_Os06g40080 为已知的SE5 基因,编码血红素加氧酶 1(heme oxygenase 1,HO1).HZ1/SE5 在叶片中高表达,在LD及SD条件下具有昼夜节律性表达.亚细胞定位发现HZ1/SE5 蛋白定位于叶绿体中.表达调控分析表明HZ1/SE5主要通过调控水稻成花素Hd3a和RFT1 的表达来调控水稻的抽穗期;并通过调控叶绿素合成途径相关基因的表达水平影响水稻叶绿素水平变化.[结论]黄化早抽穗突变体hz1 由于血红素加氧酶编码基因SE5 突变导致其对光周期不敏感,HZ1/SE5 基因通过调控水稻成花素基因及叶绿素合成途径相关基因的表达而影响水稻的抽穗期及叶片的黄化.

[目的]WRKY转录因子参与植物对低磷胁迫反应的调控.基于前期苦荞在低磷胁迫下的转录组数据,克隆FtWRKY28基因,预测基因及其编码蛋白的序列结构特征,分析基因在各器官中以及在低磷和激素处理下的表达模式、蛋白的亚细胞定位与转录激活活性,为阐明基因的生物学功能奠定基础.[方法]基于苦荞基因组数据库注释设计特异引物,用逆转录PCR从低磷处理的苦荞根RNA样中克隆FtWRKY28的完整编码序列,用生物信息学方法分析基因与蛋白的结构以及同源蛋白的进化关系,用实时荧光定量分析基因的表达模式,用拟南芥原生质体瞬时表达体系分析蛋白的亚细胞定位,用酵母单杂交分析蛋白的转录激活活性.[结果]FtWRKY28的完整编码序列长876 bp,编码1个含291个氨基酸、有1个WRKY结构域、锌指结构域为C2 H2型的蛋白,归属WRKY家族Ⅱ组.FtWRKY28绝大部分定位于细胞核,具有转录激活活性.FtWRKY28在根中表达水平最高,受低磷、吲哚乙酸、赤霉素3和6-苄氨基嘌呤显著诱导.[结论]FtWRKY28具有转录因子的基本结构与生物化学特征,可能通过生长素、赤霉素、细胞分裂素信号网络的交互作用,调控苦荞在低磷胁迫下的响应过程.

[目的]鉴定重要农作物小麦(Triticum aestivum L.)上参与糖酵解的烯醇化酶家族成员ENO2 编码基因TaENO2,分析TaENO2 的可变翻译特征及产物蛋白的烯醇化酶活性.[方法]采用生物信息学方法鉴定小麦基因组中的TaENO2 基因;选择1 个TaENO2 为代表,以原生质体为受体通过外源表达方法分析该基因的可变翻译产物,通过原核表达和亲和层析过程纯化该基因的重组蛋白产物并测定其烯醇化酶活性.[结果]小麦的六倍体基因组中含有 3 个部分同源的TaENO2 基因,3 个基因的产物蛋白含有保守的烯醇化酶活性中心,编码烯醇化酶蛋白序列第 94 位甲硫氨酸残基(M94)的ATG密码子(ATGM94)是潜在的内部可变翻译起始位点.在原生质体中,外源导入的TaENO2 表达出定位于细胞质和细胞核的全长产物烯醇化酶和定位于细胞核的N端截短产物转录抑制因子TaMBP-1 两种蛋白,而外源导入的突变ATGM94 后的TaENO2基因只表达全长产物烯醇化酶.获得了纯度较高的可溶性重组蛋白GST-TaENO2,该重组蛋白在体外能够催化由 2-磷酸-甘油酸(2-PGA)向磷酸烯醇丙酮酸(PEP)转变的烯醇化酶反应.[结论]小麦基因组含有 3 个烯醇化酶ENO2 编码基因TaENO2.在外源表达的情况下,TaENO2 表现可变翻译特征,可分别从第一起始密码子和内部ATGM94 密码子处起始表达出全长形式的烯醇化酶蛋白和N端截短形式的TaMBP-1 蛋白.原核表达的重组蛋白GST-TaENO2 具有体外烯醇化酶活性.

[目的]植物线粒体基因变异是产生细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)的主要原因,利用生物技术是创造CMS不育系的重要手段.通过比较启动子、线粒体转运信号肽(mitochondrial targeting signal peptides,MTS)的不同组合对下游eGFP的表达强弱,来探究最佳马铃薯线粒体靶向表达载体.[方法]选择 3 个启动子AtUBI10、StUBI10、2×35S和两个线粒体转运信号肽ATPγ与Rf1b进行试验,利用烟草叶片瞬时表达系统和PEG介导马铃薯原生质体转化体系进行靶向载体的表达验证.[结果]六个线粒体靶向表达载体中AtUBI10::ATPγ-eGFP在烟草瞬时表达效果最佳,可准确定位到线粒体,其次为StUBI10::ATPγ-eGFP和 2×35S::ATPγ-eGFP;在马铃薯原生质体中载体AtUBI10::ATPγ-eGFP有最佳的表达效果,与烟草中表达结果一致,其次是StUBI10::Rf1b-eGFP和AtUBI10::Rf1b-eGFP,而 2×35S启动子的两个载体在原生质体均表达较弱.[结论]启动子AtUBI10 与线粒体转运信号肽ATPγ所构建的靶向线粒体载体为最佳组合,可用于马铃薯线粒体基因的相关研究中.

为研究檀香NDH脱氢酶基因的功能和调控机制,该文以檀香心材为材料,利用RACE技术克隆SaNDH6基因的全长序列,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析其组织和激素处理后的表达模式,在拟南芥原生质体观测其亚细胞定位,利用PlantCARE分析SaNDH6起始密码子ATG上游2 kb的启动子序列,同时运用PlantRegMap预测可能与其结合的转录因子.结果表明:(1)SaNDH6编码303个氨基酸,为疏水蛋白,亚细胞定位于叶绿体.(2)进化树分析表明,檀香SaNDH6与木本植物NDH6进化关系较近.(3)PlantCARE分析发现,SaNDH6启动子中除含有ACE、AE-box、Box 4、G-Box和GT 1-motif等大量光响应元件外,同时还有茉莉酸甲酯(MeJA)反应元件CGTCA-motif和TGACG-motif,赤霉素(GA3)响应元件P-box,以及防御和胁迫响应元件TC-rich repeats等.(4)PlantRegMap分析发现,有76个转录因子可能与SaNDH6启动子结合,其中ERF家族最多,达40个.(5)SaNDH6在檀香的根、心材、叶片和愈伤组织中均有表达,其中在叶片中的表达量较高;用1×10-4 mol·L-1的MeJA和GA3分别处理檀香愈伤组织后,与处理前(0 h)相比,SaNDH6的表达均在3 h后显著升高.综上结果表明,檀香SaNDH6为核基因编码的蛋白,受光和激素等诱导表达,SaNDH6可能参与檀香逆境胁迫反应的过程.

基于CRISPR-dCas9的基因转录激活表达能够避免基因异位表达带来的表型干扰,同时使基因有效地特异性表达.该研究利用新型CRISPR-Act3.0表达系统,在毛果杨(Populus trichocarpa)中对维管形成层特异表达转录因子ANT(AINTEGUMENTA)进行基因转录激活,创制遗传材料,并对基因的功能进行分析.首先对毛果杨PtrANTs转录因子进行同源分析,选取其中的PtrANT-4进行后续研究,对该基因进行克隆并利用荧光定量PCR分析其在各组织中的表达情况;其次在PtrANT-4启动子上设计3条gRNAs,构建CRISPR-dCas9转录激活表达载体,利用原生质体瞬时转化法检测该载体的表达;最后将该表达载体利用农杆菌介导法转化毛果杨,获得PtrANT-4转录激活遗传材料.结果表明:毛果杨中有4个PtrANTs转录因子,选取的PtrANT-4基因CDS序列全长为2 058 bp,编码685个氨基酸,在毛果杨侧生分生组织维管形成层特异表达.基于CRISPR-Act3.0表达系统成功构建的转录激活载体,在毛果杨木质部原生质体中转化后具有激活PtrANT-4表达的作用.获得的遗传转化植株中PtrANT-4基因仅在茎维管形成层中的表达量显著提高,说明PtrANT-4在茎维管形成层发育过程中可能起重要作用.该研究为PtrANT的功能研究奠定了一定研究基础,同时为维管形成层干细胞发育的机制研究提供了重要的遗传材料.

[目的]NAC转录因子家族是植物中研究较多的一类转录因子,在调控植物生长发育和响应非生物胁迫过程中起重要作用.玉米是三大粮食作物之一,其生长过程常会面临各种逆境胁迫,盐害被认为是限制作物生长和生产的主要环境因素之一.因此鉴定玉米抗盐基因,解析其抗盐机制对培育玉米抗逆品种具有重要意义.[方法]研究克隆了玉米转录因子ZmNAC59,并用生物信息学手段分析其保守结构域和系统进化关系,用实时荧光定量PCR方法分析该基因在NaCl和MeJA处理下的表达模式,并用稳定转基因体系将该基因异源表达拟南芥观察表型,同时还用病毒诱导沉默技术将该基因在玉米中沉默后进行盐处理表型观察,并进行酶活性检测.[结果]ZmNAC59能够被NaCl和MeJA诱导上调.病毒诱导沉默ZmNAC59后进行盐胁迫,沉默株系对盐胁迫更敏感,ROS积累更多;而ZmNAC59过表达拟南芥后,过表达株系在盐胁迫处理下存活率更高,活性氧积累更少,Na+/K+比率低,表明ZmNAC59作为盐胁迫中的正调控因子可以通过调节离子流动提高植物抗盐性.实时荧光定量PCR结果表明拟南芥过表达株系中Na+、K+转运相关的基因显著上调;在玉米原生质体中瞬时过表达ZmNAC59后进行盐处理发现ZmSOS1、ZmNHX1和ZmNHX7的表达显著上调,Dual-LUC实验表明ZmSOS1是Zm-NAC59的靶基因.[结论]研究表明ZmNAC59通过激活ZmSOS1启动子的活性调控其表达而促进盐胁迫下的离子转运,从而提高植物抗盐性,为玉米抗逆基因资源的筛选和品种培育提供了科学理论依据.

叶绿素是水稻光合作用的重要色素,叶绿素的合成决定光合作用的效率,影响植物的产量和品质.在本研究中,发现糖原合成酶激酶OsGSK2过表达植株Go-2成熟期呈现叶片深绿色的表型.相比野生型,Go-2植株叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素含量显著升高.透射电镜观察结果显示,相比野生型,Go-2植株叶绿体类囊体片层增多.酵母双杂交"一对一"实验证实OsGSK2与Golden2-Like转录因子OsGLK1存在互作,并进一步通过双分子荧光互补实验确认OsGSK2与OsGLK1存在互作.在水稻原生质体中检测双荧光素酶活性发现,相比单转OsGLK1,OsGSK2与OsGLK 1共转显著提高下游靶基因的表达水平.荧光定量PCR结果表明,相比野生型,在Go-2植株中OsGLK1直接调控的靶基因OsPORB、OsCAO1、LHCB6等转录水平显著上调.研究结果初步揭示了OsGSK2与OsGLK1互作调控水稻叶绿素合成和叶绿体发育的分子机理,进一步拓展了水稻糖原合成酶激酶的分子功能,丰富了水稻叶色调控的分子网络,为水稻高光合分子育种提供了理论依据.

目的 选育他克莫司高产菌株,优化培养基配方,提高发酵产量.方法 采用原生质体融合技术对2株筑波链霉菌进行基因组重排,并经响应面设计对发酵培养基配方进行优化.结果 以紫外灭活作为遗传标记经过4轮基因组重排育种后,摇瓶筛选获得3株高产菌株,其中菌株FK22-71菌丝球松散、椭圆状,发酵浸泡液颗粒状.该菌株稳定高产,采用响应面设计优化后的配方在50 L罐发酵产量平均达1684 mg/L.结论 基因组重排技术应用于他克莫司高产菌株选育,可大幅提高发酵产量,为其工业化发酵生产奠定了基础.

茯苓Wolfiporia hoelen是一种食药兼用的大型真菌,在我国栽培历史悠久,但由于长期无性繁殖,导致菌种退化,栽培产量下降,严重影响产业发展.为解决茯苓育种的难题,我们前期建立了茯苓同核体鉴定方法,明确了其交配系统,建立了单孢同核体杂交育种体系,但是部分茯苓菌株子实体形成困难或子实体贴生,导致担孢子收集困难,因此原生质体单核化的研究具有重要意义.本研究以两株存在较大遗传差异且同核体类型不同的菌株 776 和 775 为材料,核荧光染色表明超过60%的原生质体具有细胞核,原生质体再生率分别为11.0%和7.6%,不易生长的再生菌株中既有同核也有异核菌株.原生质体单核化获得了两个菌株的同核体菌株,比例可达到10%以上,菌株776 获得了两种交配型的同核体菌株(5:3),不存在偏分离(χ2=0.5),但菌株 775 原生质体单核化仅获得了一种交配型的同核体菌株,表现出严重的交配型偏分离.通过杂交菌株与两亲本对峙试验及基于rpb2 的杂合位点验证,证实获得了原生质体同核体杂交菌株 25 株,原生质体同核体与单孢同核体杂交菌株 50 株,表明茯苓原生质体同核体杂交育种的可行性.