实验旨在探讨饲料添加N-氨甲酰谷氨酸(NCG)或牛磺酸(Taurine)对杂交鳢(Channa maculata ♀ × C.argus ♂)幼鱼肠道生长、消化、抗氧化和肠道菌群的影响.实验选取初始体均重为(22.02±0.02)g的杂交鳢450尾,随机分为3个组,每组3个重复,每个重复50尾,分别投喂基础饲料以及在基础饲料中添加0.03％N-氨甲酰谷氨酸、1％牛磺酸的3种实验饲料,记作对照组,0.03％NCG组和1％Taurine组,饲喂8周.结果表明,饲料中添加0.03％NCG或1％Taurine可显著提高杂交鳢蛋白质沉积率(P＜0.05),提高肠道淀粉酶和肌酸激酶活性(P＜0.05),促进前肠肌层厚度、中肠绒毛宽度、中肠肌层厚度和后肠肌层厚度生长(P＜0.05),增强肠道厚壁菌群和支原体属丰度(P＜0.05),显著降低饲料系数和肠道丙二醛含量(P＜0.05),显著降低肠道梭杆菌群和梭菌属丰度(P＜0.05).此外,饲料中添加0.03％NCG可显著提高杂交鳢肠道总抗氧化能力、过氧化物酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性(P＜0.05),显著缓解肠道病理状态(P＜0.05),显著提高杂交鳢肠道胰蛋白酶、脂肪酶、γ-谷氨酰转移酶和钠钾ATP酶活性(P＜0.05),促进前肠绒毛长度、前肠绒毛宽度和后肠肌层厚度生长(P＜0.05),并显著提高肠道OUT占比、Chao和Ace指数(P＜0.05),增强肠道菌群丰富度和多样性(P＜0.05).结果表明饲料中添加NCG在增强肠道抗氧化活性,缓解肠道氧化损伤方面优于添加牛磺酸,但饲料添加牛磺酸可以增强肠道消化酶活性,增强肠道菌群丰富度和多样性,维持肠道稳态并促进肠道生长,其作用效果优于补充NCG.

[背景]舒伯特气单胞菌为革兰氏阴性短杆菌,是一种人-畜-鱼共患的条件性致病菌,它能引起不同程度的人类疾病,近年来更是在水产养殖中被频繁报道.[目的]比较分析4株杂交鳢源舒伯特气单胞菌(WL-4、ZL-1、ZL-13、D075)菌株间生理生化特性、致病性以及对常用药物的敏感性差异,为水产舒伯特气单胞菌病的防治提供参考依据.[方法]使用全自动细菌生化鉴定仪检测菌株的生理生化特性;运用PCR扩增和测序比对菌株的gyrB、16S rRNA基因序列;采用改良平板法检测毒力因子表达,PCR技术检测菌株毒力基因和耐药基因的携带情况;通过人工注射感染分析4株舒伯特气单胞菌对杂交鳢的致病性差异;并采用微量二倍稀释法测试15种抗菌药物对菌株的最小抑菌浓度.[结果]以ATCC43700(人源舒伯特气单胞菌)作为参考,4株菌株理化特性基本相同,gyrB和16S rRNA基因一致性分别为99.57％和100％,聚类分析聚为一簇;不同的舒伯特气单胞菌(ATCC43700、WL-4、ZL-1、ZL-13、D075)均具有溶血性、蛋白酶活性和脂肪酶活性;但人源菌株(ATCC43700)与杂交鳢源舒伯特气单胞菌携带的毒力基因存在差异,其中人源菌株携带了hlyA、ela、lip、ahal、act,而杂交鳢源菌株(WL-4、ZL-1、ZL-13、D075)携带hlyA、ela、lip、ahal、aer;4株杂交鳢源舒伯特气单胞菌对杂交鳢致病性存在差异,1.2×105 CFU/mL浓度腹腔注射感染健康杂交鳢,WL-4、ZL-1、ZL-13、D075对杂交鳢的感染致死率依次为30％、40％、70％和80％;不同菌株(ATCC43700、WL-4、ZL-1、ZL-13、D075)的药物敏感性以及携带的耐药基因也存在差异.[结论]4株杂交鳢源舒伯特气单胞菌在致病性、药物敏感性等方面存在差异,研究结果有助于进一步开展舒伯特气单胞菌病发病机制和防控技术研究.

人工养殖乌斑杂交鳢(Channa maculate♀×C.argus♂)受鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)侵害日益严重,为深入研究该菌的致病机理,鰤鱼诺卡氏菌感染乌斑杂交鳢的感染模型亟待建立.本研究通过对菌液浓度与吸光值、半致死剂量、组织病理学和病理组织切片等方面进行研究.结果 表明菌液浓度为4.75× 104～4.75×107 cfu/mL范围时与其吸光值呈线性关系.通过人工感染实验,确定鰤鱼诺卡氏菌感染乌斑杂交鳢的半致死剂量(LD50)为1.52× 105 cfu/尾.组织病理学分析发现,鰤鱼诺卡氏菌感染乌斑杂交鳢会引起皮肤溃烂、内脏器官肿大,形成白色结节.病理组织切片显示,结节中心呈干酪样坏死,周围有大量细胞浸润.研究结果为建立鰤鱼诺卡氏菌感染乌斑杂交鳢的动物模型及研究鰤鱼诺卡氏菌致病机制提供科学依据.

为初步探索鱼类PKCθ基因在抵御病原菌感染过程中的作用,本研究进行了杂交鳢(Channa maculata ♀×C.argus ♂)PKCθ(CmaPKCθ)基因克隆及其在舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)、鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)感染后的表达分析.克隆获得CmaPK Cθ的完整开放阅读框(ORF)长度为2 151 bp,预测编码716个氨基酸,具有保守的C1、C2样、C3和C4结构域.Blast分析表明CmaPKCθ氨基酸序列与尖吻鲈(Lates calcarifer) PKCθ的同源性最高,达92％.氨基酸多重序列比对显示CmaPKCθ具有保守的磷酸化位点和泛素化位点.系统进化树结果显示杂交鳢与其他鱼类的PKCθ聚为一个分支,其中与尖吻鲈PKCθ亲缘关系最近.实时荧光定量PCR结果表明,CmaPKCθ在健康杂交鳢的所有被检组织中广泛表达,其中在肝脏中表达水平最高,其次为脾脏、胸腺和头肾,在肌肉中的表达量最低.舒伯特气单胞菌和鰤鱼诺卡氏菌分别感染杂交鳢后,其肝脏、脾脏和头肾分别在第5天、第5天、第12小时和第10天、第2天、第3天时达到表达峰值(p＜0.05),CmaPKCθ的表达变化相似,在不同时间点的肝脏、脾脏和头肾中,均主要表现为上调.上述结果表明,C maPKCθ可能在杂交鳢激活T细胞增殖活化和抵御病原菌感染过程中发挥重要作用,本研究结果可为病原菌和鱼体的免疫互作机制研究及其病害防控提供参考.

肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2,TRAF2)是一种重要的胞内信号接头蛋白,参与激活NF-κB和MAPK信号通路,在免疫防御、炎症反应和细胞凋亡等过程发挥关键作用.为了探索杂交鳢(Channa maculate ♀ x Channa argus ♂)TRAF2功能及其对两种病原菌感染的应答机制,本研究克隆获得杂交鳢TRAF2(命名为CmaTRAF2)基因的完整开放阅读框(ORF),长度为1 566 bp,预测编码521个氨基酸,与龟壳攀鲈(Anabas testudineus)、杜氏鰤(Seriola dumerili)TRAF2蛋白序列相似性最高,都达到91％.与其他TRAF2相似,CmaTRAF2具有一个RING结构域、一个锌指结构域、一个TRAF结构域.系统发育分析表明CmaTRAF2与其他硬骨鱼类TRAF2聚为一支,其中与龟壳攀鲈TRAF2的亲缘性关系最近.实时荧光定量PCR检测分析显示CmaTRAF2在健康杂交鳢所检测的9种组织中广泛分布,其中脾脏中表达量最高,头肾中的表达量次之,肝脏中的表达量最低.采用鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)腹腔注射感染杂交鳢后,肝脏、脾脏和头肾中CmaTRAF2的表达在感染后不同时间点总体呈现为上调趋势,且分别在10h、l d和2d时达到最大值(P＜0.05).舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)注射感染杂交鳢后,CmaTRAF2的表达变化相似,也主要呈现上调趋势,且分别在肝脏、脾脏和头肾中于12 h、5 d和2 d时达到峰值(P＜0.05).以上结果表明,CmaTRAF2参与了杂交鳢抵御鰤诺卡氏菌和舒伯特气单胞菌感染的免疫应答反应.本研究可为进一步探索鱼类TRAF2的免疫防御和信号转导机制提供基础资料.

[背景]鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是一种革兰氏阳性好氧菌,易引起鲈形目鱼类结节病发生,近几年对大口黑鲈、杂交鳢等名优鱼类的危害越来越大.[目的]比较分析9株不同年份、不同地区患结节病的不同淡水鱼品种分离的鰤诺卡氏菌的种间同源关系、生长特性、致病性以及药物敏感性差异,为进一步研究制定相应的防控与治疗措施提供基础数据和科学依据.[方法]在9株试验菌生理生化实验鉴定结果基础上,采用16S rRNA基因序列比对、限制性片段长度多样性比较菌株间的同源性;扩增看家基因secA1基因序列进行不同来源菌株种内相似度比对;通过体外培养比较不同菌株的生长情况;人工注射感染分析9株试验菌对大口黑鲈的致病性差异;采用微量肉汤二倍稀释法测试9株试验菌对13种抗菌药物的最小抑菌浓度;运用PCR技术检测菌株携带毒力基因和耐药基因的情况.[结果]生理生化结果显示9株试验菌与鰤诺卡氏菌的基本理化特征相符;9株试验菌聚类分析聚为一类,种内相似度高,限制性片段长度多样性酶切图谱相同,生长特性无明显差异;9株试验菌对大口黑鲈致病性无显著差异,但毒力基因携带情况略有不同,其均携带mce1A、mig和pup基因,而dop和whiB3只在部分菌株检出;9株试验菌均对氟甲喹和氨苄西林耐药,除NS1外,都对磺胺间甲氧嘧啶耐药,对大部分抗菌药物敏感,主要携带blaTEM和sul1耐药基因.[结论]不同时间、不同地区及不同宿主分离的9株鰤诺卡氏菌在生物学特性、致病性和药物敏感性等方面无明显差异;同源性相近,提示华南地区感染淡水鱼的鰤诺卡氏菌可能为同一流行株型.研究结果为鰤诺卡氏菌的发病机制及防控技术的进一步研究奠定了基础.

[背景]鰤诺卡氏菌是一种典型的条件致病菌,感染鳢、鲈等多种名优鱼类,易造成存在机体损伤或免疫机能下降的鱼持续性感染,给水产养殖业造成了巨大损失.[目的]了解临床分离鳢源鰤诺卡氏菌对乌斑杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)的致病性,并从全基因组层面了解该病原菌的基因组和致病因子信息,为鰤诺卡氏菌后续病原学及鰤诺卡氏菌病防治技术和疫苗的开发研究提供有利的数据支撑.[方法]鰤诺卡氏菌NK201610020通过回归感染试验和发病鱼靶器官组织病理分析,了解鰤诺卡氏菌的毒力和病理特征.通过对试验菌进行全基因组测序和比较基因组学分析,挖掘该菌的基因组与毒力特征.[结果]回归感染试验结果显示,除1.5×103组外,其余5个感染组致死率高达90％,LD50为1.079×103 CFU/mL,说明试验菌毒力较强.组织病理学观察到肝、脾、肾呈现严重的病理损伤,而且有肉芽肿结构形成.试验菌全基因组测序发现,全基因组大小为8 294 329 bp,GC含量为68.10％,共预测到编码基因7 812个.比较基因组学分析发现,不同地区不同宿主来源鰤诺卡氏菌在基因组基础特征层面无明显差异,而且一致性在99.9％以上.通过毒力基因数据库比对,预测试验菌全基因组中有171个编码序列可能为毒力基因,其功能主要与细胞壁合成、营养代谢、细菌持续感染相关.[结论]鰤诺卡氏菌毒力强,基因组序列保守,携带多种毒力因子,研究结果为进一步研究鰤诺卡氏菌的致病机制提供了有利的数据支撑.

为了开发云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢及其杂交尖塘鳢种间特异性分子标记,选择泛素化相互作用基序包含蛋白1(sumo?interacting motif?containing protein 1,simc1)基因作为候选基因.利用该基因mRNA序列设计引物对P 1针对3种尖塘鳢基因组进行扩增,均扩增到893 bp的外显子序列.该序列在3种尖塘鳢种内个体间均未获得单核苷酸多态性(singe nucleotide polymorphisms,SNP)位点,但种间共存在21个SNP位点,其中有7个同义突变,14个错义突变.选择较容易设计引物的SNP15位点设计等位基因特异性PCR(allele specific PCR,AS?PCR)引物对P2和P3.利用这两对引物针对待测样品基因组进行扩增,若P2扩增出222 bp条带,而P 3无扩增条带,则样品为线纹尖塘鳢;若P 2无扩增条带,而P 3扩增出566 bp条带,则为云斑尖塘鳢;若P 2和P 3同时扩增出222 bp和566 bp条带,则为杂交尖塘鳢.通过对模板进行梯度稀释,检测P2和P3引物对灵敏度,结果表明,P2引物对检测的基因组最低浓度为5×10-4mg/L,P3引物对检测的基因组最低浓度为5×10-2 mg/L.3种尖塘鳢特异性SNP标记的开发及快速检测方法的建立,可为尖塘鳢种质资源鉴定及新品种培育等工作提供技术支撑.