目的:网络药理学结合GEO数据集探讨翻白草治疗 2 型糖尿病的分子机制.方法:通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)下载翻白草化学成分信息,经SwissADME对各成分进行筛选和SwissTargetPrediction预测靶点后,得到药物作用靶点.采用R软件下载GEO数据中GSE系列,提取表达矩阵,对原始数据进行归一化处理后提取临床信息,采用limma程序包进行 2 型糖尿病差异基因分析.通过微生信在线平台获取药物作用靶点和疾病差异基因交集,即为翻白草治疗 2 型糖尿病的潜在作用靶点,对潜在作用靶点进行生物信息学分析,采用分子对接方法对分析结果进行验证.结果:筛选得到翻白草中 20 个化学成分,经SwissTargetPrediction预测后,得到374 个药物作用靶点,R软件分析获得 2 型糖尿病差异基因 658 个,取交集后得到 17 个潜在作用靶点.经过基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析可知,翻白草有效成分有原儿茶酸、咖啡酸、山柰酚、3,4,5-三羟基苯甲酸、罗索酸,通过作用蛋白激酶C-θ(PKC-θ)、核转录因子-κB p65 亚单位(RELA)、核糖体蛋白S6 激酶α3(RPS6KA3)、信号传导和转录激活因子 3(STAT3)、乳酸脱氢酶B(LDHB)和 6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶同工酶 3(PFKFB3)靶点,参与胰岛素抵抗通路(P<0.01)、低氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路(P<0.01)和脂肪细胞因子信号通路(P<0.01)来发挥治疗 2 型糖尿病作用.分子对接结果显示,PKC-θ、RELA、STAT3 与咖啡酸,RPS6KA3 与罗索酸,LDHB与 3,4,5-三羟基苯甲酸,PFKFB3 与山柰酚之间均具有较好的对接活性.结论:通过网络药理学结合GEO数据集,初步预测了翻白草治疗 2 型糖尿病的潜在靶点和可能的作用机制,为翻白草治疗 2 型糖尿病的进一步研究提供理论依据.

目的 探索建立复方用药条件下中药间接毒性的肝损伤风险预测模式,为基于间接毒性认知的中药肝损伤评价研究提供新的思路及方法.方法 以补骨脂制剂为模式药物,通过筛选补骨脂的高频配伍中药,运用TCMSP、TCMIP、PharmMapper数据库筛查高频配伍中药的成分及作用靶点,对作用于核因子κB(NF-κB)通路的中药进行关联强度值及风险值分析,同时大于关联强度值和风险值中位数的中药为筛选获得的间接肝损伤风险中药,从而构建基于免疫活化相关的间接肝损伤作用过程(以NF-κB通路为例)的肝损伤风险中药预测模式,在此基础上按照补骨脂研究方法采用何首乌制剂开展预测模式的验证.结果 基于免疫活化的重要通路(NF-κB通路为例)的肝损伤风险药物预测模式筛选发现淫羊藿(关联强度值0.18、风险值0.25)为补骨脂制剂中具有间接肝损伤潜在风险的配伍中药,其可能通过正调控NF-κB通路上的布鲁顿酪氨酸激酶(Btk)和蛋白激酶C theta(PKCθ)增加肝损伤风险.进一步以何首乌制剂为对象,采用上述方法开展预测模式验证,发现补骨脂(关联强度值0.25、风险值0.33)、菟丝子(关联强度值0.34、风险值0.33)或可增加何首乌肝损伤的风险.结论 构建了中药间接毒性肝损伤风险预测模式,可以为复方用药条件下中药间接肝损伤风险药物识别提供一定的方法学参考.

蛋白激酶C-θ(PKC-θ)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,作为免疫突触的重要组成部分、共刺激分子的下游分子,在T细胞活化过程中发挥着重要作用.PKC-θ表达的局限性不仅能用于调节T细胞功能,也可作为抗病毒药物的潜在靶点.对PKC-θ的深入研究有助于进一步了解复杂的细胞信号传导,帮助疾病的诊断与治疗.文章就PKC-θ在T细胞活化过程中的作用机制,以及在艾滋病病毒(HIV)感染中的相关生物学效应进行论述.

目的 探讨5-羟色胺2A受体(5-HT2AR)和蛋白激酶C(PKC)通路在慢性间歇低氧(CIH)大鼠颈动脉体窦神经(CSN)放电活性长时程易化(LTF)中的调节作用.方法 采用数字表法将24只成年SD大鼠随机分为A组(生理盐水对照组)、B组(5-HT2AR拮抗剂组)、C组(PKC抑制剂组)和D组(5-HT2AR拮抗剂+PKC抑制剂组),每组6只.将动物置于低氧动物仓中进行间歇低氧处理,每天8h(9:00至17:00),连续4周.在稳定记录CSN电信号后,对A、B、C三组大鼠分别静脉给予生理盐水、5-HT2AR拮抗剂(ketanserin)或PKC抑制剂(PKC θ伪底物),10 min后再进行3次急性间歇低氧(AIH)处理,每次5 min,间隔5 min,之后立即记录CSN电信号.对D组大鼠,先给予ketanserin,10 min后给予PKC θ伪底物,再进行3次AIH刺激和CSN电信号记录.结果 四组大鼠在AIH处理前的基线CSN放电振幅差异无统计学意义(P＞0.05).经AIH处理后,A组大鼠在30min时CSN放电振幅为(5.01±0.53)μV,60 min时为(4.95±0.34) μV,明显高于AIH前水平(P＜0.01),提示AIH能够诱导CIH预处理大鼠发生CSN放电活性LTF.B组大鼠在注射ketanserin 后,AIH刺激30 min后CSN的放电振幅为(3.79±0.42)μV,60 min后为(3.73±0.46)μV,仍明显高于AIH前水平(P＜0.01),提示阻滞5-HT2AR并不能完全抑制大鼠窦神经LTF的产生.C组及D组大鼠在AIH刺激前后CSN的放电振幅均变化不明显,差异无统计学意义(P＞0.05),提示通过阻断PKC通路或5-HT2A R/PKC通路均可完全抑制CSN的LTF.结论 5-HT2AR及PKC通路参与调节了CIH大鼠发生的颈动脉体窦神经LTF.

SUMO化修饰具有广泛的功能,包括调控神经突触的形成和传递.神经突触和免疫突触共享某些特性,而蛋白激酶Cθ(protein kinase Cθ,PKCθ)是蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)家族中唯一能在抗原刺激后定位于免疫突触中央超分子活化簇的一员.为了探讨SUMO化修饰对免疫突触的影响,该文采用“Ubc9融合介导的SUMO化修饰系统(Ubc9 fusion-directed SUMOylation system,UFDS)”方法检测Ubc9-PKCθ与SUMO的相互作用;应用体外定点突变技术构建多个SUMO化修饰位点突变的Ubc9-PKCθ;通过荧光显微镜观察Raji B-Jurkat T细胞之间的接触面.结果显示,Ubc9-PKCθ能被SUMO化修饰,且抗原刺激后能在免疫突触聚集;而当多个SUMO化修饰位点突变后,Ubc9-PKCθ的SUMO化水平显著下调,抗原刺激后虽然还是被招募到免疫突触上,但呈现弥散状态.综上所述,Ubc9融合表达时SUMO化修饰影响PKCθ在免疫突触的聚集.

近年来,利用免疫分子基因敲除动物模型、从免疫学机制分析入手对炎症性肠病(或称炎性肠疾病,inflammatory bowel disease,IBD)的探讨,极大地推动了对于IBD病因和发病机制的认识.特别是通过敲除白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)及其受体的基因而诱发小鼠IBD的实验研究,揭示了IBD可能与自身免疫性疾病有关,进一步认识了调控IL-2基因转录的蛋白激酶C-theta(protein kinase c-theta,PKC-θ)的作用和潜在应用价值.本文主要阐述IL-2基因敲除小鼠发生IBD的特点、以及T淋巴细胞的PKC-θ信号通路在此过程中的作用.

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD )与胰岛素抵抗息息相关.两者的流行是异位脂肪堆积的结果,但两者的发病机制尚有争议.30余年前,丝/苏氨酸激酶的蛋白激酶C(PKC)家族已被证实与肝脏、肌肉、脂肪细胞中的胰岛素功能改变相关,并提出了NAFLD与胰岛素抵抗之间的假定关系.PKC家族通过磷酸化和第二信使(如钙、二酰甘油)活化,人们根据各种第二信使的要求定义PKC的类别.新型PKC(如θ和ε)是依赖甘油二酯的,非钙依赖的,能通过异位脂质堆积调整细胞事件.有人设计了一个模型,模型中sn-1 ,2-二酰甘油的异位堆积能激活骨骼肌和肝脏中的PKC亚型(PKCθ和ε),从而减少该组织的胰岛素信号传导[1 ].在肝脏中,PKCε通过磷酸化催化域中的关键苏氨酸残基(小鼠中的T1150)来破坏胰岛素受体激酶(INSR)活化[2].sn-1 ,2-二酰甘油、PKCε活化和胰岛素抵抗之间的关系,部分解释了某些人群中NAFLD患者肝胰岛素抵抗的发展,也解释了肝胰岛素抵抗随体质量减轻或其他减少肝脂肪含量的疗法(如噻唑烷二酮)而逆转的原因[1,3].

目的 探讨蛋白激酶C-θ(PKC-θ)在吗啡诱导初始T细胞分化模型中的作用及潜在机制.方法 取小鼠脾脏,制备单细胞悬液,使用分离试剂盒获得初始T细胞.将提纯的初始T细胞分为六组:对照组、吗啡组、纳洛酮(吗啡拮抗剂)组、AEB071(PKC-θ抑制剂)组、吗啡+纳洛酮组和吗啡+AEB071组.按组别加入不同刺激物培养,收取细胞,采用流式细胞仪检测Th1和Th2细胞数量,采用ELISA法检测细胞因子IL-4和IFN-γ浓度,采用Western blot法检测PKC-θS676、T538两个位点的磷酸化水平,采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测GATA3 mRNA表达量,采用凝胶迁移实验(EMSA)检测GATA3转录活性.结果 与对照组比较,吗啡组Th2细胞数量明显增多,IL-4浓度明显升高,PKC-θS676、T538两个位点的磷酸化水平明显升高,GATA3 mRNA表达量及转录活性均明显升高(P<0.01).与吗啡组比较,吗啡+纳洛酮组和吗啡+AEB071组Th2细胞数量明显减少,IL-4浓度明显降低,PKC-θS676、T538两个位点的磷酸化水平明显降低,GATA3 mRNA表达量及转录活性均明显降低(P<0.01).六组Th1细胞数量和IFN-γ浓度差异无统计学意义.结论 吗啡通过μ受体激活PKC-θ调控Th2细胞分化,PKC-θ可能作为逆转吗啡免疫抑制功能的一个干预靶点.

为初步探索鱼类PKCθ基因在抵御病原菌感染过程中的作用,本研究进行了杂交鳢(Channa maculata ♀×C.argus ♂)PKCθ(CmaPKCθ)基因克隆及其在舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)、鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)感染后的表达分析.克隆获得CmaPK Cθ的完整开放阅读框(ORF)长度为2 151 bp,预测编码716个氨基酸,具有保守的C1、C2样、C3和C4结构域.Blast分析表明CmaPKCθ氨基酸序列与尖吻鲈(Lates calcarifer) PKCθ的同源性最高,达92％.氨基酸多重序列比对显示CmaPKCθ具有保守的磷酸化位点和泛素化位点.系统进化树结果显示杂交鳢与其他鱼类的PKCθ聚为一个分支,其中与尖吻鲈PKCθ亲缘关系最近.实时荧光定量PCR结果表明,CmaPKCθ在健康杂交鳢的所有被检组织中广泛表达,其中在肝脏中表达水平最高,其次为脾脏、胸腺和头肾,在肌肉中的表达量最低.舒伯特气单胞菌和鰤鱼诺卡氏菌分别感染杂交鳢后,其肝脏、脾脏和头肾分别在第5天、第5天、第12小时和第10天、第2天、第3天时达到表达峰值(p＜0.05),CmaPKCθ的表达变化相似,在不同时间点的肝脏、脾脏和头肾中,均主要表现为上调.上述结果表明,C maPKCθ可能在杂交鳢激活T细胞增殖活化和抵御病原菌感染过程中发挥重要作用,本研究结果可为病原菌和鱼体的免疫互作机制研究及其病害防控提供参考.

为了研究尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)蛋白激酶C theta (PKCθ)和Spartin的蛋白表达情况,本实验在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达和提纯了尼罗罗非鱼PKCθ和Spartin的重组蛋白,并利用日本大耳兔(Oryctolagus cuniculus)制备了相应的多克隆抗体.用间接ELISA技术检测抗体效价,Western Blot鉴定抗体的特异性,并检测其在罗非鱼肝、脾、肠和肌肉组织中的表达情况.结果 表明,实验成功构建了原核表达载体pET-B2m-PKCθ和pET-B2m-Spartin,实现了重组蛋白的原核表达和纯化.PKCθ重组蛋白主要存在于包涵体中,分子量约为56 ku;Spartin重组蛋白分子量约为30 ku,以包涵体蛋白的形式存在.获得的多克隆抗体效价均高达1∶512 000,Western Blot检测结果表明,制备的抗体能特异性识别尼罗罗非鱼PKCθ和Spartin多种异构体;PKCθ蛋白在罗非鱼肝、脾、肠与肌肉组织中均有表达;Spartin蛋白在罗非鱼的肝、脾和肠组织中不表达,在肌肉组织中表达.研究表明,尼罗罗非鱼PKCθ和Spartin重组蛋白在大肠杆菌中成功表达,获得了高效价的多克隆抗体,并明确了尼罗罗非鱼PKCθ和Spartin在不同组织中的表达情况,为进一步研究尼罗罗非鱼PKCθ和Spartin的功能及其作用机制奠定了基础.