目的:观察温化蠲痹方治疗类风湿关节炎(RA)的临床疗效,研究其对RA患者耐药基因P-糖蛋白(P-gP)表达影响,探讨温化蠲痹方治疗RA的增效机制.方法:60例RA患者随机分为两组,中药温化蠲痹方加西药治疗组(治疗组)30例,对照组30例,其中对照组口服甲氨蝶呤片(MTX,每周1次,每次7.5 mg),来氟米特片(每天1次,每次10 mg),美洛昔康片(莫比可,每天2次,每次7.5 mg).治疗组在口服上述西药的同时,加用温化蠲痹汤(每天1剂,分2次口服)治疗,观察12周.观察两组临床疗效,治疗前后症状、体征、实验室指标,包括中医症候疗效分析、健康状况评估(HAQ评分)、疾病活动指数(DAS28)、患者疼痛评估(VAS评分)、晨僵时间、血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸肽抗体(抗CCP抗体)、血小板计数、P-gP表达、安全性指标等,运用实时定量PCR检测外周血P-gP表达.结果:治疗组总有效率(86.6％)优于对照组(76.6％),差异有统计学意义(P＜0.05).在改善DAS28、HAQ评分、VAS评分、关节肿胀数、关节压痛数、晨僵时间,与本组治疗前和对照组治疗后比较,差异均有统计学意义(P ＜0.05,P＜0.01);两组患者P-gP、ESR、CRP、RF、抗CCP抗体、血小板计数等指标,与本组治疗前比较,差异均有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01),治疗组治疗后上述指标改善优于对照组(P＜0.05,P＜0.01);两组出现肝酶升高、白细胞下降、胃肠道反应、感染及血压升高等,治疗组低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:中药温化蠲痹方加西药治疗RA疗效优于单独西药治疗,温化蠲痹方可降低RA患者多药耐药基因P-gP表达,改善患者对DMARDs多药耐药,可能是其治疗RA提高临床疗效机制之一,该方治疗RA患者安全、有效.

目的:研究鸟嘌呤释放蛋白1(RASGRP1)在中药温化蠲痹方影响微小RNA-146a(miRNA-146a)对胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠外周血单个核细胞(PBMC)DNA甲基化调控中的作用,探讨温化蠲痹方治疗CIA作用机制.方法:随机将健康雌性Wistar大鼠分为造模组和正常对照组(n=10,正常组),造模组在大鼠尾根部注射牛Ⅱ型胶原乳剂,建立胶原诱导性关节炎模型.30只造模成功大鼠随机分组如下:模型组(n=10)、甲氨蝶呤组(n=10,MTx组)及中药温化蠲痹方组(n=10,中药组).中药组大鼠按22.9 g/(kg·d)灌胃中药温化蠲痹方,模型组给予生理盐水灌胃,两组大鼠都是每天1次,MTx组灌胃MTx混悬液(0.78 mg/kg),每周1次,共观察30 d.采用容积法(排水体积)评价足趾肿胀度.给药结束后,对正常组、模型组PBMC细胞培养,模型组加入ras-MARKs阻断剂,阻断荆①SB230580、阻断剂②PD98059、阻断剂③SP600125,模型组加中药,正常组转染miRNA-146a,模型组转染反义miRNA-146a.采用实时定量PCR法检测miRNA-146a、DNMTs(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)表达水平,Western Blot检测RASGRP1表达.结果:(1)与正常组比较,模型组大鼠足趾肿胀明显,差异有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较,中药组和MTX组大鼠足趾肿胀明显减轻,差异有统计学意义(P＜0.01);MTX组与中药组比较,大鼠足趾肿胀差异无统计学意义(P＞0.05);与治疗前比较,中药组和MTX组大鼠足趾肿胀减轻,差异有统计学意义(P＜0.01).(2)体内实验:与正常组比较,模型组大鼠外周血RASGRP1表达升高,差异有统计学意义(P＜0.01).与模型组比较,中药组、MTX组RASGRP1表达降低,差异有统计学意义(P＜0.01).中药组、MTX组之间比较,差异无统计学意义(P＞0.05).体外实验:与正常组比较,模型组、正常转染miRNA-146a组PBMC RASGRP1表达升高,差异有统计学意义(P＜0.01).与模型组比较,模型加中药组、模型转染反义miRNA-146a组RASGRP1表达降低,差异有统计学意义(P＜0.01).与模型组比较,模型加阻断剂①组、加阻断剂②组、加阻断荆③组PBMC RASGRP1表达降低,差异有统计学意义(P＜0.01).(3)相关性分析:模型组、模型加阻②、③、加中药组、转染miRNA-146a组、转染反义miRNA-146a组大鼠PBMC miRNA-146a表达水平与DNMT1、DNMT3a、DNMT3b呈显著负相关.结论:温化蠲痹方可能作用于RASGRP1影响ras-MARKs通路,发挥对微小RNA-146a调控CIA大鼠PBMC DNA甲基化作用,是其治疗胶原诱导性关节炎作用机制之一.

目的 研究温化蠲痹方对胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠成纤维样滑膜细胞(FLS)微小RNA-146a(miRNA-146a)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、白细胞介素-1受体相关激酶1(IRAK1)基因表达的影响.方法 选用雌性Wistar大鼠70只,按随机数字表法分为正常组(10只,生理盐水每天1 次)和造模组(60只).造模组采用尾部皮内多点注射牛Ⅱ型胶原乳剂的方法进行免疫,建立CIA模型.造模成功后(40只)用随机数字表法分为温化蠲痹方组(中药组,温化蠲痹方每天22.9 g/kg,每天1次灌胃)、模型组(生理盐水2 mL每天1次灌胃)、甲氨蝶呤组(MTX组-MTX混悬液每周0.78 mg/kg,每周1次灌胃)和温化蠲痹方加MTX组(中药加西药组,灌胃药物同中药组及MTX组),每组10只.采用容积法(排水体积)和计分法分别评价足趾肿胀度和关节炎症程度.治疗30天后处死大鼠,取各组膝关节滑膜,运用HE染色,光镜下观察大鼠滑膜病理;采用5级评分法评定滑膜炎细胞浸润和滑膜细胞增生的程度;运用实时荧光定量PCR检测滑膜中miRNA-146a、TRAF6、IRAK1基因表达水平.结果 与正常组比较,模型组大鼠足趾肿胀明显,滑膜炎性细胞浸润和增生程度明显(P＜0.05);模型组miRNA-146a、TRAF6、IRAK1基因表达明显升高(P＜0.01).与模型组比较,中药组、MTX组、中药加西药组足趾肿胀明显减轻,关节滑膜炎性细胞浸润和增生程度显著减轻,miRNA-146a、TRAF6、IRAK1基因表达明显降低(P＜0.05).与MTX组比较,中药加西药组miRNA-146a、TRAF6、IRAK1基因表达更低(P＜0.05).结论 中药温化蠲痹方可能通过抑制成纤维样滑膜细胞miRNA-146a、TRAF6、IRAK1基因表达从而抑制CIA大鼠成纤维样滑膜细胞增生,发挥其抗炎作用.MTX加用温化蠲痹方比单纯MTX治疗效果更好.

目的 研究ras-MAPKs信号通路在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)微小RNA-146a(miRNA-146a)对DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)调控中的作用,以及温化蠲痹方干预作用.方法 提取RA患者、健康受试者PBMCs进行体外培养研究.将18例健康受试者随机分为6组,每组均为3例,分别为正常组,正常转染miRNA-146a组(转染组),正常转染miRNA-146a加中药组(中药1组),正常转染miRNA-146a加MAPKs特异性阻断剂PD98059组(阻断1组)、SB203580组(阻断2组)、SP600125组(阻断3组).将符合中医辨证为寒热错杂、痰瘀痹阻型的活动期RA患者15例,随机分为5组,每组3例,分别为RA组,RA加中药组(中药2组),RA加MAPKs特异性阻断剂PD98059组(阻断4组)、SB203580组(阻断5组)、SP600125组(阻断6组).对受试者PBMCs进行体外培养、转染、加通路阻断剂以及含药血清,运用实时定量PCR检测PBMC中miRNA-146a、DNMTs、RASGRP1的表达.结果 阻断1～6组miRNA-146a表达降低,DNMTs表达升高,RAS-GRP1表达降低(均P＜0.05).中药1、2组RSAGRP1表达降低(均P＜O.05).结论 ras-MAPKs信号通路可能参与了RA患者miRNA-146a对DNMTs的调控.中药温化蠲痹方可能通过下调RA患者RASGRP1表达作用于ras-MAPKs信号通路,影响miRNA-146a对DNMTs进行调控,达到治疗RA作用.

目的 研究温化蠲痹方对微小核糖核酸-146a(miRNA-146a)/核因子κB(NF-κB)环路诱导胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠成纤维样滑膜细胞(FLS)凋亡作用及其相关分子机制.方法 选用雌性Wistar大鼠25只,按随机数字表法分为正常组(10只)和造模组(15只),造模组采用尾部皮内多点注射牛Ⅱ型胶原乳剂的方法进行免疫,建立CIA模型.在造模成功后(12只,造模成功率为80％)随机选取10只作为模型组,分别取正常大鼠和CIA大鼠的关节滑膜,用组织块培养法培养出原代FLS,培养至第3代进行干预实验.分别过表达、沉默miRNA-146a,并加入通路阻断剂和含药血清共培养,应用荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测miRNA-146a、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、白细胞介素-1受体相关激酶1(IRAK1)基因表达;Western Blot法检测磷酸化核因子κB p65(NF-κB p65,p-p65)、核因子κB抑制因子α(I κ B α)、增殖细胞核抗原(PCNA)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)蛋白表达;流式细胞术检测各组FLS凋亡;CCK-8法检测各组FLS增殖.结果 与正常组比较,模型组大鼠足掌厚度明显增加(P＜0.01);正常转染miRNA-146a组miRNA-146a、TRAF6、IRAK1基因表达及PCNA、p-p65蛋白表达增加,Caspase-3、Iκ Bα蛋白表达及FLS凋亡率降低(P＜0.05);正常转染反义miRNA-146a组miRNA-146a、TRAF6、IRAK1基因表达及PCNA、p-p65蛋白表达降低,Caspase-3、I κ Bα蛋白表达及FLS凋亡率增加(P＜0.05).与CIA对照组比较,CIA转染miRNA-146a组TRAF6、IRAK1基因表达及PCNA、p-p65蛋白表达增加,Caspase-3、IκBα蛋白表达及FLS凋亡率降低(P＜0.05);CIA转染反义 miRNA-146a 组 TRAF6、IRAK1 基因表达及 PCNA、p-p65 蛋白表达降低,Caspase-3、IκBα 蛋白表达及FLS凋亡率增加(P＜0.05).加入NF-κB通路阻断剂后,随着阻断时间延长及PCNA、p-p65蛋白表达降低,Caspase-3、IκBα蛋白表达增加(P＜0.05).与对照血清组比较,中药含药血清组细胞增殖率降低(P＜0.05).结论 温化蠲痹方可以通过miRNA-146a/NF-κ B环路诱导FLS凋亡、抑制FLS增殖.

目的 研究温化蠲痹方对胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠炎症及N6-甲基腺苷(m6A)甲基化的影响.方法 选用雌性Wistar大鼠50只,随机分为正常组(n=10)和造模组(n=40).采用尾部皮内多点注射乳化剂的方法建立CIA模型.采用容积法(排水体积)和关节炎指数(AI)评分法对模型进行评估,足肿胀体积>1.6 mL、AI评分≥4分视为造模成功.将造模成功的30只CIA大鼠随机分为模型组(n=10)、温化蠲痹方组(中药组,n=10)、甲氨蝶呤(MTX)组(n=10).中药组给予温化蠲痹方,剂量为22.9 g·kg-1·d-1;MTX组给予甲氨蝶呤混悬液,剂量为0.78 mg·kg-1,每周1次;正常组和模型组给予等量质量分数为0.9%的氯化钠溶液,每日1次.治疗30 d取各组大鼠膝关节滑膜.采用HE染色法检测滑膜病理情况,以realtime PCR法检测滑膜中甲基转移酶样蛋白3(Mettl3)、甲基转移酶样蛋白14(Mettl14)、肥胖相关蛋白(Fto)、Alkb同系物5(Alkbh5)、YthN 6-甲基腺苷RNA结合蛋白1(Ythdf1)、Yth N6-甲基腺苷RNA结合蛋白2(Ythdf2)基因表达及关节炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)基因表达水平,并采用Western blot法检测Mettl3、Fto蛋白表达.结果 与正常组比较,模型组大鼠足肿胀体积、AI评分明显升高,Mettl3、Mettl14、Fto、Alkbh5、Ythdf1基因表达增加,Ythdf2基因表达降低,TNF-α、IL-1β、IL-6基因表达增加,Mettl3、Fto蛋白表达增加,差异均有统计学意义(P<0.05).与模型组比较,中药组和MTX组足肿胀体积、AI评分均随时间延长逐渐降低,Mettl3、Mettl14、Fto、Alkbh5、Ythdf1基因表达降低,Ythdf2基因表达增加,TNF-α、IL-1β、IL-6基因表达降低,Mettl3、Fto蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05).与MTX组比较,中药组Mettl3、Mettl14、Fto、Alkbh5、Ythdf1基因表达降低,Ythdf2基因表达增加,TNF-α、IL-1β、IL-6基因表达降低,Mettl3、Fto蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 中药温化蠲痹方可能通过影响m6A甲基化来发挥抗炎作用,从而对CIA起到治疗效果.

目的 以胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠为实验对象进行体内实验,从Hotair/Wnt1/β-连环蛋白(p-catenin)信号通路的角度,分析温化蠲痹方(WHJBD)对类风湿关节炎(RA)的干预机制.方法 选用雄性DBA/1J小鼠建立CIA模型,将造模成功小鼠按随机数字表法分为4组:模型组(CIA组)、温化蠲痹方组(WHJBD组)、甲氨蝶吟组(MTX组)、WHJBD+MTX组,每组6只.并随机选取同一批次的正常小鼠6只作为正常组.WHJBD组每天予WHJBD灌胃(25.78 g/kg)、MTX组每周予MTX灌胃(1.288 mg/kg)、WHJBD+MTX组同时予WHJBD及MTX灌胃,正常组及CIA组予同等剂量生理盐水灌胃,均持续4周.采用游标卡尺测量足掌和踝关节的肿胀程度并计算关节肿胀度,实时荧光定量PCR法检测各组Hotair、Wnt抑制因子1(WIF1)、C-myc、G1/S-特异性周期蛋白(CyclinD1)表达水平,免疫组化法检测Wnt1、β-catenin、肿瘤增殖抗原抗体(Ki-67)、Caspase3、B淋巴细胞瘤-2(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平.结果 与CIA组比较,WHJBD、MTX、WHJBD+MTX组干预后小鼠关节肿胀度随着干预时间的增加逐渐降低;增殖相关蛋白Ki-67表达减少,凋亡相关蛋白Caspasse3、Bax表达增加,Bcl2表达减少;Hotair、WIF1基因表达增加,C-myc、CyclinD1基因表达减少;通路蛋白Wnt1、β-catenin表达减少;差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 WHJBD具有减轻CIA小鼠足掌和踝关节肿胀度和关节炎程度,调节Hotair/Wnt1/β-catenin通路和滑膜组织的增殖、凋亡,发挥治疗CIA小鼠作用.