研究乳源性外泌体与脂质体进行膜融合得到的杂化外泌体装载青藤碱(sinomenine,SIN)后对胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠的治疗效果.通过蔗糖密度梯度离心法从鲜牛乳中提取外泌体,采用乳化蒸发-低温固化法制备脂质体,共孵育法进行膜融合后对杂化外泌体进行表征:透射电镜检测形貌,纳米粒度电位仪检测粒径与电位,蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测膜融合前后外泌体膜表面特征蛋白CD63和TSG101的表达.超声法装载青藤碱后,酶标仪检测其载药量与包封率.胶原抗体诱导法建立CIA大鼠模型,药效实验设对照组、模型组、SIN组、SIN-脂质体组、SIN-乳外泌体组、SIN-杂化外泌体组及阳性药(地塞米松)组.记录给药期间大鼠体质量变化,以足肿胀度、免疫器官指数、关节炎指数、微循环指标变化、滑膜组织病理学检查、血清炎症因子水平变化为指标进行药效学研究.透射电镜结果显示,杂化外泌体与乳外泌体外观均呈茶托状,共孵育后外泌体粒径由(97.92±3.42)nm 增长到(132.70±4.07)nm,Zeta 电位由(-2.01±0.33)mV 变为(-17.90±2.13)mV,WB结果显示CD63与TSG101蛋白在乳外泌体及杂化外泌体中均正常表达.酶标仪测定乳外泌体包封率31.64％±2.48％、载药量2.35％±0.52％,杂化外泌体包封率48.21％±3.12％、载药量3.17％±0.36％.药效学结果显示,与模型组相比,各给药组一般情况及足肿胀度、关节炎指数及免疫器官指数均得到显著改善(P＜0.05,P＜0.01),微血管综合评分及血管阻力显著下降(P＜0.05,P＜0.01),血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)炎症因子水平显著降低(P＜0.01),滑膜组织的病变得到一定程度的改善.同时与SIN组、SIN-脂质体组及SIN-乳外泌体组相比,SIN-杂化外泌体组具备更平稳持久的药效.该研究将乳源性外泌体与脂质体共孵育得到的杂化外泌体成功改善了外泌体载药量小与脂质体生物相容性差等问题,负载青藤碱的杂化外泌体对CIA大鼠有着良好的疗效,可有效解决青风藤等疗效佳但生物半衰期短的问题,为传统中药的新发展及类风湿性关节炎等疾病的治疗提供了新思路.

研究祖师麻及其炮制品对SD大鼠Ⅱ型胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)中辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)分化的影响.按体质量将64只SD大鼠随机分为正常组,模型组,祖师麻炙品低、高剂量组,生品低、高剂量组,祖师麻甲素组,雷公藤多苷组.除正常组外,CIA模型在第1次免疫后第7天进行二免,并在二免7 d后灌胃28 d.取材后,采用苏木素-伊红(HE)染色观察CIA大鼠关节滑膜炎症的情况;采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中转化生长因子-β(TGF-β)、γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-10水平变化;实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法检测关节滑膜中分化簇80(B7-1)、分化簇86(B7-2)、分化簇28(CD28)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)mRNA和蛋白表达;流式细胞术用于检测大鼠关节滑膜中Th17和Treg细胞的比例.结果显示,与正常组相比,模型组大鼠的关节滑膜炎症明显加剧,关节炎指数评分明显上升,免疫器官指数上升(P＜0.01);与模型组相比,各给药组均能不同程度地改善大鼠的关节炎症,降低关节评分指数,抑制滑膜增生,降低免疫器官指数;相较于模型组,各给药组中大鼠血清中IL-2、IFN-γ 显著下降(P＜0.01),TGF-β、IL-4、IL-10 显著上升(P＜0.01),滑膜中 B7-1、CTLA-4 mRNA 及蛋白表达显著升高(P＜0.01),关节组织中的Th17细胞和Treg细胞的比例出现显著降低(P＜0.01).综上得出祖师麻通过调控B7/CD28/CTLA-4通路以及调节Th17/Treg平衡,抑制CIA大鼠中Th17细胞的表达,促进Treg细胞的表达,进而治疗RA.

目的:通过 99Tc m-联肼尼克酰胺-3聚乙二醇-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸环肽二聚体(3PRGD 2)显像在体观察类风湿关节炎(RA)大鼠蒙药森登-4汤治疗前后放射性分布变化，并探究其治疗机制。 方法:取200只雌性SD大鼠(6~7周龄)，分为胶原诱导性关节炎(CIA)组(176只)和空白对照组(24只)。将CIA模型大鼠通过简单随机抽样法分为森登-4汤治疗组(24只)、依那西普治疗组(24只)和阴性对照组(24只)。造模及治疗前后均行 99Tc m-3PRGD 2显像，分析各组病变关节与纵隔的靶/非靶(T/NT)放射性比值，分析相应血清学、病理及免疫组织化学指标。采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis秩和检验分析数据。相关性分析采用Pearson或Spearman相关分析。 结果:CIA组成功造模95只，成模率为54%(95/176)。治疗后，阴性对照组、森登-4汤治疗组、依那西普治疗组T/NT比值差异有统计学意义(0.766±0.144、0.260±0.094和0.238±0.099； F＝163.00， P<0.001)，而2个药物治疗组间差异无统计学意义( P>0.05)。药物治疗后，血清血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、整合素α vβ 3表达水平均显著低于阴性对照组( F值：49.43~92.36，均 P<0.001)；关节病理滑膜细胞增生指数也明显低于阴性对照组( H＝34.25， P<0.001)；滑膜组织中VEGF、TNF-α、整合素α vβ 3、CD31、CD34表达水平也显著低于阴性对照组( H值：13.51~26.84，均 P<0.001)，而2组药物治疗组间上述指标差异均无统计学意义(均 P>0.05)。治疗后，森登-4汤治疗组( r值：0.56~0.59， rs值：0.49~0.69)、依那西普治疗组( r值：0.50~0.55， rs值：0.46~0.70)和阴性对照组( r值：0.55~0.80， rs值：0.58~0.86)的T/NT比值与上述各指标均呈正相关( P<0.001或 P<0.05)。 结论:通过 99Tc m-3PRGD 2显像与分子病理验证，蒙药森登-4汤可通过下调VEGF等血管因子抑制新生血管形成，延缓病情进展、改善临床症状。

目的:探索78c对RA和小鼠胶原诱导性关节炎（CIA）的治疗及作用机制。方法:用78c处理小鼠CIA模型和人CD38 +NK细胞，用流式细胞术检测小鼠外周血和细胞培养液中各细胞因子浓度及各淋巴细胞亚型。用Miltenyi细胞分离试剂盒从健康志愿者外周血单核细胞中分离CD4 +T细胞和NK细胞，然后用Miltenyi CD38微珠从NK细胞中富集CD38 +NK细胞，最后将CD38 +NK细胞与CD4 +T细胞在Transwell中共培养。单因素方差分析进行多组间显著性差异分析，LSD法进行2组间比较，Pearson法进行秩相关分析。 结果:78c注射第21天后，与CIA小鼠[（4.70±0.56）mm]相比，78c明显抑制小鼠CIA足趾厚度[（4.07±0.20）mm]（ t=5.07， P<0.001）；其外周血中白细胞、中性粒细胞、血小板、IFN-γ、IL-6及TNF-α水平明显降低（ t=6.10， P<0.001； t=4.00， P=0.002； t=3.09， P=0.012； t=2.31， P=0.043； t=3.58， P=0.005； t=2.68， P=0.002）。CD38 +NK细胞的比例从[（3.9±0.9）%]降低到[（2.4±0.3）%]（ t=2.49， P=0.032），调节性T细胞（Treg）比例从[（0.81±0.33）%]升高到[（1.41±0.26）%]（ t=2.74， P=0.021），IL-10浓度也从[（99±37）pg/ml]升高到[（199±9）pg/ml]（ t=2.76， P=0.020）。与CD38 + NK细胞共培养后的CD4 +T细胞相比，和78c预处理的CD38 +NK细胞共培养后CD4 +T细胞中Treg比例从[（0.52±0.04）%]上升到[（0.69±0.08）%]（ t=3.33， P=0.029），辅助性T细胞（Th）17/Treg比值从（4.44±0.26）下降到（2.59±0.64）（ t=4.76， P=0.009），Thl/Th2的比值从（14.78+1.58）下降到（8.12±1.26）（ t=5.70， P=0.005）。 结论:78c可以通过降低CD38 +NK细胞比例提升CD4 +T细胞分化Treg的能力，恢复免疫平衡和缓解关节炎症，可能是RA潜在的治疗药物。

目的:探讨 99Tc m－联肼尼克酰胺－3聚乙二醇－精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸环肽二聚体(3PRGD 2)对类风湿关节炎(RA)早期诊断的可行性。 方法:取60只雌性Wistar大鼠，分为空白对照组10只(注射生理盐水0.3 ml/只)、胶原诱导性关节炎(CIA)组50只(注射Ⅱ型胶原乳剂0.3 ml/只)。2组均在造模前及造模后25和45 d行 99Tc m－3PRGD 2平面显像，测量并分析造模成功的CIA组大鼠在造模前后病变关节与纵隔的靶/非靶比值(T/NT)变化情况，并与同期空白对照组进行比较；另行病理学检测。采用重复测量方差分析和两独立样本 t检验分析数据。 结果:CIA组32只大鼠造模成功，显像示病变关节有明显的滑膜炎及滑膜增厚特征，并有血管翳形成。32只CIA组大鼠造模前及造模后25和45 d病变关节部位T/NT分别为0.158±0.023、0.402±0.144和0.705±0.163( F＝286.924, P<0.01)。造模后25和45 d时CIA组大鼠病变关节部位T/NT与空白对照组相应结果(0.160±0.028和0.158±0.032)比较差异均有统计学意义( t值：－10.484和－20.917，均 P<0.01)。免疫组织化学检查示CIA组大鼠病变关节滑膜组织血管内皮生长因子、α vβ 3、肿瘤坏死因子－α呈阳性表达。 结论:99Tc m－3PRGD 2对大鼠RA模型关节滑膜新生血管显像的灵敏度高，有望用于RA的早期诊断。

目的:通过构建胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠模型，利用非靶向代谢组学的研究方法，探讨甲氨蝶呤治疗类风湿关节炎的作用机制。方法:采用ELISA测定血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10的含量，苏木精-伊红（HE）染色及Masson染色观察各组大鼠关节组织学改变，非靶向气相色谱-质谱代谢组学技术筛查血清差异代谢物表达谱并进行聚类分析和KEGG富集分析，筛查出差异性代谢途径，并采用实时定量聚合酶链反应对差异性代谢途径中的关键酶进行检测。将所有符合正态分布的实验数据，采用单因素方差分析比较组间差异，以 P<0.05表示差异具有统计学意义。 结果:甲氨蝶呤（MTX）可明显改善CIA大鼠的关节炎症反应和关节炎评分（ P<0.05），增加CIA大鼠的体质量（ P<0.05）。HE和Masson染色结果显示MTX可改善CIA大鼠滑膜组织对关节软骨的侵蚀。ELISA结果显示MTX可显著降低CIA大鼠血清中TNF-α[（191.2±17.4）pg/ml， F=40.31， P<0.001]、IL-1β[（28.4±1.2）pg/ml， F=10.11， P=0.012]和IL-6[（118.7±1.4）pg/ml， F=829.40， P<0.001]的含量，提高血清中IL-4[（49.3±3.3）pg/ml， F=33.44， P<0.001]和IL-10[（30.2±0.7）pg/ml， F=33.44， P<0.001]的含量。非靶向代谢组学结果显示MTX对CIA大鼠血清中的磷酸胆碱、棕榈酸、油酸、胆碱等代谢产物有影响。KEGG通路富集分析结果显示MTX对CIA大鼠的甘油磷脂代谢（ P<0.01）和鞘脂代谢（ P<0.05）有影响。实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）结果显示MTX可下调CIA大鼠关节滑膜甘油磷脂代谢途径中关键酶磷脂酶B1（Plb1）[（1.00±0.49）， F=8.23， P=0.019]、甘油磷胆碱磷酸二酯酶（Gpcpd1）[（1.10±0.09）， F=8.19， P=0.019]、胆碱激酶α（Chka）[（1.33±0.19）， F=33.00， P<0.001]，胆碱激酶β（Chkb）[（2.07±1.21）， F=8.20， P=0.019]和磷酸乙醇胺/磷酸胆碱磷酸酶1（Phospho1）[（1.07±0.14）， F=13.58， P=0.006）的表达水平，也可下调鞘脂代谢途径中关键酶3-酮二氢鞘氨醇还原酶（Kdsr）[（1.24±0.32）， F=13.85， P=0.006]、磷脂磷酸酶（Plpp1）[（1.61±0.32）， F=11.95， P=0.003]和鞘脂去饱和酶1（Degs1）[（1.21±0.15）， F=46.55， P<0.001]的表达水平。 结论:MTX治疗RA的生物学机制可能与下调机体的甘油磷脂代谢和鞘脂代谢通路的代谢水平有关。

目的:探讨雷公藤甲素调控Caspase-1/Gasdermins D蛋白（GSDMD）通路干预胶原诱导性关节炎大鼠骨破坏的作用及机制。方法:将大鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、雷公藤甲素组、甲氨蝶呤组，每组5只。除空白组外，其余各组大鼠尾根部注射牛Ⅱ型胶原建立关节炎模型。加强免疫7 d后，雷公藤甲素组灌胃雷公藤甲素18 μg/kg，1 d/次；甲氨蝶呤组腹腔注射甲氨蝶呤0.3 mg/kg，3 d/次，连续干预15 d。记录大鼠关节炎指数（AI）评分与足趾容积变化，采用HE染色观察大鼠踝关节组织形态学改变，番红固绿染色观察大鼠踝关节软骨及骨改变；ELISA法检测大鼠血清IL-18、IL-1β水平；实时荧光定量PCR法检测大鼠踝关节GSDMD、Caspase-1、骨骼保护因子（OPG）、NF-κB受体活化因子配体（RANKL）mRNA水平；Western blot法检测踝关节组织中GSDMD、Caspase-1、OPG、RANKL蛋白表达。结果:给药1、2周，与模型组比较，雷公藤甲素组、甲氨蝶呤组AI评分及足趾容积数值降低（ P<0.01）；模型组大鼠踝关节组织可见大量炎性细胞浸润、滑膜血管翳生成，软骨及骨染色潮线模糊缺损，各给药组均不同程度改善大鼠关节炎性浸润、滑膜血管翳生成、关节软骨及骨破坏。与模型组比较，雷公藤甲素组与甲氨蝶呤组大鼠血清IL-18、IL-1β水平降低（ P<0.01），GSDMD、Caspase-1、RANKL mRNA及蛋白表达降低（ P<0.01），OPG mRNA及蛋白表达升高（ P<0.01）。 结论:雷公藤甲素可有效改善胶原诱导性关节炎大鼠关节炎症与骨破坏表现，其作用机制可能与下调GSDMD、Caspase-1、RANKL表达，上调OPG表达相关。

目的:网络药理学探究壮医清毒伸筋方治疗类风湿关节炎(RA)的作用机制.方法:检索中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、人类在线孟德尔遗传数据库(OMIM)、人类基因数据库(GeneCards)获取清毒伸筋方与RA交集靶点.网络可视化和分析软件(Cytoscape)获取主要活性成分,归一化相互匹配法(NCC)计算核心靶点.对核心靶点进行基因本体(GO)富集分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,用分子对接分析主要活性成分与核心靶点的结合力.构建胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠模型验证主要蛋白浓度.结果:获得145种活性成分和238个药靶点,交集靶点151个.富集分析提示交集靶点涉及19个GO富集分析条目和晚期糖基化终末产物(AGEs)-晚期糖基化终末产物受体(RAGE)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路等75条信号通路.主要活性成分为槲皮素、柄花黄素、豆甾醇、木犀草素、β-谷甾醇;分子对接结果显示它们与前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)等蛋白具有良好的结合性.动物实验验证,清毒伸筋方有效减轻CIA大鼠关节肿胀程度,显著降低血清MMP9、AKT1和PTGS2浓度.结论:清毒伸筋方发挥多成分、多靶点、多通路特点作用于RA的炎症级联反应.

背景:课题组前期研究发现二仙丸加减方可以缓解胶原诱导性关节炎大鼠炎症反应,但其作用机制尚需进一步验证.目的:分析二仙丸加减方入血成分,观察二仙丸加减方含药血清对J774A.1巨噬细胞焦亡的影响.方法:①二仙丸加减方入血成分分析:采用超高效液相色谱-高分辨质谱(UHPLC-HRMS)对二仙丸加减方及入血成分进行检测和鉴定.②二仙丸加减方含药血清对J774A.1巨噬细胞焦亡的影响:采用分子对接技术对二仙丸加减方入血成分倍半萜类化合物与NLRP3进行初步验证.将J774A.1巨噬细胞随机分为空白对照组、脂多糖+三磷酸腺苷组及脂多糖+三磷酸腺苷+二仙丸加减方含药血清低(2.5%)、中(5%)、高(10%)剂量组.根据试剂盒说明书检测各组细胞上清液中乳酸脱氢酶释放情况;ELISA检测各组细胞上清液中白细胞介素1β、白细胞介素18水平;Hoechst/PI染色法检测各组细胞膜受损情况;Western blot检测各组细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD及GSDMD-N蛋白表达水平.结果与结论:①共鉴定出二仙丸加减方药效成分32个,入血成分21个,其中入血成分主要包括多种倍半萜类化合物;②分子对接结果显示3-O-Acetyl-13-deoxyphomenone、Incensol oxide、Atractylenolide III、Rupestonic acid、3,7-Dihydroxy-9,11-eremophiladien-8-one与NLRP3之间结合活性较好;③与空白对照组相比,脂多糖+三磷酸腺苷组细胞上清中乳酸脱氢酶活性及白细胞介素1β、白细胞介素18水平均显著升高(P<0.001),Hoechst/PI染色可见PI阳性细胞数量显著增加.脂多糖+三磷酸腺苷+二仙丸加减方含药血清各组上述指标均显示不同程度降低;④与空白对照组相比,脂多糖+三磷酸腺苷组NLRP3、Caspase-1、GSDMD及GSDMD-N蛋白表达显著升高(P<0.05);与脂多糖+三磷酸腺苷组相比,脂多糖+三磷酸腺苷+二仙丸加减方含药血清各组细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD及GSDMD-N蛋白表达均有不同程度降低(P<0.05),且具有一定的剂量依赖性.结果表明:二仙丸加减方含药血清可能通过调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路抑制J774A.1巨噬细胞焦亡.

目的:探讨汉黄芩素(WOG)通过核因子E2相关因子2(NRF2)/血红素加氧酶1(HO-1)信号途径诱导胶原诱导性关节炎大鼠成纤维细胞样滑膜细胞(大鼠CIA-FLS细胞)铁死亡的机制.方法:将大鼠CIA-FLS细胞分为:对照组、低、中、高剂量(25、50和100 μmol/L)汉黄芩素组、铁死亡抑制剂(LIP-1)组、LIP-1+高剂量汉黄芩素组、HO-1激动剂钴原卟啉(COPP)组和COPP+高剂量汉黄芩素组,CCK-8法检测细胞活力;结晶紫染色法检测细胞形态;检测氧化应激标志物谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的水平;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)的含量,Western blot检测Kelch样ECH关联蛋白1(KEAP-1)、NRF2和HO-1蛋白表达水平.结果:与正常对照组相比,给予WOG处理后,大鼠CIA-FLS细胞活力显著下降(P<0.01),氧化应激水平显著上升(P<0.01),ROS含量显著增加(P<0.01),NRF2和HO-1蛋白表达水平显著下降(P<0.01),KEAP-1水平显著增加(P<0.01);与WOG组相比,LIP-1处理组的细胞活力显著上升(P<0.01),氧化应激水平显著下降(P<0.01),ROS含量显著减少(P<0.01);与WOG组相比,加入COPP后,NRF2和HO-1蛋白表达水平显著上升(P<0.01),KEAP-1水平显著下降(P<0.01).结论:WOG能通过NRF2/HO-1信号途径,促进氧化应激来诱导大鼠CIA-FLS细胞铁死亡.