目的:观察人肝癌(HCC)细胞外泌体环状RNA(circRNA)-100338对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管形成能力的影响。方法:提取、纯化和鉴定上海复旦大学肝癌研究所建立MHCC97H细胞来源外泌体，并共孵育中国科学院上海细胞所HUVEC细胞(37 ℃、5%CO 2)，外泌体示踪实验追踪外泌体能否被HUVEC细胞内化。采用Lipofectamine? 2000转染试剂转染MHCC97H细胞，提取干扰circRNA-100338后的HCC细胞上清液外泌体(1 g/L)；增殖实验用于检测HUVEC细胞增殖能力变化(测量波长450 nm)；血管形成能力实验用于评估HUVEC细胞成管(×100)。统计分析采用独立样本 t检验。 结果:透射电子显微镜观察到MHCC97H细胞来源的外泌体多数呈圆形或椭圆形，粒径分布峰值在120 nm，符合外泌体粒径特征，蛋白质印迹法(Western blot)检测到外泌体标志蛋白。MHCC97H细胞来源的外泌体被HUVEC细胞内化。肝癌circRNA-100338干扰组和对照组的外泌体分别共培养HUVEC细胞48、72、96 h后HUVEC细胞增殖[吸光度( A)值]分别为0.358±0.005和0.436±0.011，差异有统计学意义( t＝－16.227, P<0.01)、0.661±0.052和0.888±0.031，差异有统计学意义( t＝－ 9.146, P<0.01)及1.191±0.084和1.542±0.038，差异有统计学意义( t＝－9.296, P<0.01)，干扰组血管内皮细胞增殖能力和对照组比较显著下降，差异有统计学意义( P<0.05)。干扰组HUVEC成管能力下降，成管结节细小。 结论:肝癌外泌体circRNA-100338增强HUVEC细胞增殖能力，进而促进内皮细胞血管新生。

目的 研究甲胎蛋白阴性肝细胞癌(AFP-NHCC)患者血清外泌体环状RNA(circ RNA)100338,长链非编码RNA结直肠肿瘤差别表达(colorectal neoplasia differentially expressed,CRNDE)基因表达及临床预后价值.方法 选取自 2018 年 1 月～2019 年 7 月期间联勤保障部队第九四二医院诊治的AFP-NHCC患者 98 例为研究对象,以同期健康体检的 70 例健康人作为对照组.实时荧光定量PCR检测血清外泌体circ RNA 100338 和CRNDE水平.比较不同临床病理特征AFP-NHCC患者血清外泌体circ RNA 100338 和CRNDE水平.受试者工作特征曲线(ROC)分析外泌体circ RNA 100338,CRNDE评估BCLC分期B～C期、低分化程度及肝内淋巴结转移的临界值.Kaplan-Meier生存分析(Log-Rank检验)分析血清外泌体circ RNA 100338,CRNDE对AFP-NHCC患者生存预后的影响.单因素及多因素COX回归分析影响AFP-NHCC患者预后的因素.结果 AFP-NHCC组患者血清外泌体circ RNA100338(2.78±0.67),CRNDE的相对表达量(3.05±0.70)高于对照组(0.92±0.31,1.06±0.29),差异具有统计学意义(t=21.619,22.435,均P＜0.05).AFP-NHCC组患者血清外泌体circ RNA100338 与CRNDE表达呈显著正相关性(r=0.657,P＜0.05).BCLC分期B～C期(3.43±0.69,3.71±0.75)、低分化程度(3.64±0.73,4.27±0.74)及并发肝内淋巴结转移(3.96±0.79,4.39±0.76)AFP-NHCC患者血清外泌体circ RNA100338,CRNDE表达分别高于BCLC分期0～A期(1.87±0.60,2.13±0.61)、高中分化程度(2.02±0.64,1.97±0.61)及无肝内淋巴结转移(2.03±0.60,2.20±0.65)患者,差异均有统计学意义(t=11.648,11.707,13.699;11.100,16.857,15.211,均P＜0.05).外泌体circ RNA100338 评估BCLC分期B～C期、低分化程度及肝内淋巴结转移的临界值分别为 3.51,3.69 和 4.06,外泌体CRNDE评估BCLC分期B～C期、低分化程度及肝内淋巴结转移的临界值分别为3.79,4.31和4.45.circ RNA100338高表达组和低表达组患者三年总体生存率分别为 52.08%(25/48)和 86.00%(43/50).circ RNA 100338 高表达组患者累积生存率低于低表达组患者,差异有统计学意义(Log-Rank χ2=12.490,P＜0.05).CRNDE高表达组和低表达组患者三年总体生存率分别为51.06%(24/47)和 86.27%(44/51).CRNDE高表达组患者累积生存率低于低表达组患者,差异有统计学意义(Log-Rank χ2=15.050,P＜0.05).肿瘤BCLC分期B～C(OR=1.405,P＜0.05)、低分化程度(OR=1.921,P＜0.05)、有肝内淋巴结转移(OR=1.508,P＜0.05),circ RNA100338 高表达(OR=1.906,P＜0.05)及CRNDE高表达(OR=1.733,P＜0.05)是影响AFP-NHCC患者预后的独立危险因素.结论 AFP-NHCC患者血清外泌体circ RNA 100338,CRNDE表达升高,两者表达与肿瘤BCLC分期、病理分化程度及肝内淋巴结转移有关,是影响AFP-NHCC患者生存预后的独立危险因素.

目的 观察高转移潜能肝癌(HCC)细胞外泌体与低转移潜能HCC细胞共培养对低转移潜能HCC细胞侵袭能力的影响并探讨其机制.方法 收集4种不同转移潜能肝癌MHCC97H、MHCC97L、SMMC7721、Hep3B细胞上清液和46例HCC患者血浆,提取、纯化和鉴定外泌体,与低侵袭潜能Hep3B细胞共培养,应用侵袭实验检测Hep3B细胞侵袭能力变化、聚合酶链反应检测环状RNA(circRNA)_100338变化及明胶酶谱实验检测基质金属蛋白酶(MMP)活性变化.结果 成功提取、纯化和鉴定相应外泌体.肺转移患者的HCC外泌体中circRNA_100338水平(0.064±0.006)高于无肺转移患者的HCC外泌体中circRNA_100338水平(0.039±0.005),高转移潜能MHCC97H细胞外泌体circRNA_100338水平(0.083±0.005)高于低转移潜能Hep3B细胞外泌体circRNA_100338水平(0.021 ±0.003),MHCC97H细胞外泌体共培养Hep3B细胞,可见Hep3B细胞侵袭性能力增强,穿膜数增加(15.3±2.5比8.7±2.1),共培养组细胞circRNA_100338水平升高(0.019±0.002比0.007±0.001);MMP-9活性逐渐增强(0.062±0.001、0.147±0.002、0.315±0.003),差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 高转移潜能细胞外泌体促进HCC侵袭能力与外泌体circRNA_100338水平提高及MMP-9活性增强有关.

目的 探讨肝癌(HCC)环状RNA(circRNA)竞争性内源RNA(ceRNA)分子机制及其关联信号通路.方法 共收集10对HCC及癌旁组织,应用circRNA芯片检测其中4对HCC及癌旁组织,对circRNA芯片数据进行聚类分析,结合生物信息分析的结果筛选出目标circRNA并用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)验证;基于公开的同类型测序数据库,采用Cytoscape软件构建微小RNA(miRNA,miR)-Target-Network、miRNA-Gene-Act-Network,分析与目标circRNA关联密切的信号通路;通过免疫组织化学方法验证信号通路的关键蛋白.结果 肝癌及癌旁组织RNA提取及质检合格,环状RNA芯片检测肝癌及癌旁组织circRNA,图像清晰可见、扫描数据可靠;通过聚类分析及RT-qPCR验证结果获得circRNA_100338为候选靶标,吸附miR-141-3p,HCC中circRNA_100338水平(0.012 ±0.007)高于癌旁circRNA_100338水平(0.005±0.003) (P ＜0.05),HCC中miR-141-3p水平(0.885 ±0.354)低于癌旁miR-141-3p水平(4.066±1.628) (P＜0.01);基于我们的芯片数据,联合同类型测序数据库(GSE25599、GSE77276)分析结果显示,miR-141-3p与RHEB的mRNA表达水平的负相关性值为-0.602,circRNA_100338与RHEB显著正相关(Correlation test,P＜0.05),推断circRNA_100338/miR-141-3p调控PI3K/AKT/mTOR信号通路;免疫组化结果显示该信号通路关键蛋白RHEB在circRNA_100338高表达(circRNA_100338/GAPDH＞0.05)的HCC组织中表达增强(评分≥3),与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 肝癌circRNA_ 100338/miR-141-3p轴参与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路,RHEB蛋白表达强度与circRNA_100338水平明显相关.