目的 探讨过表达Atg5蛋白对巨噬细胞泡沫化程度的影响.方法 采用Atg5慢病毒和对照组病毒感染Raw264.7巨噬细胞,建立对照细胞系(对照组)和Atg5过表达细胞系(观察组).两组细胞分别加入50 mL/Lox-LDL诱导形成泡沫化细胞.采用Western blot分析两组细胞蛋白p62、LC3、CD36和SR-A的变化;采用高效液相法检测两组细胞内胆固醇脂(CE)、游离胆固醇(FC)和总胆固醇(TC)的变化;采用免疫荧光和电子显微镜分析两组细胞内脂滴的含量;采用ELISA检测两组细胞培养上清中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平.结果 与对照组比较,观察组细胞自噬底物p62水平显著下调,LC3-Ⅱ水平显著上调(P＜0.05).与对照组比较,观察组巨噬细胞CE、FC和TC含量均显著下调(P＜0.05).观察组细胞脂质水平和脂滴的数量较对照组明显下降(P＜0.05).与对照组比较,观察组细胞炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平显著下调(P＜0.05).结论 自噬核心蛋白Atg5过表达可显著提高巨噬细胞自噬水平,可能通过自噬降解胞内胆固醇等脂质,预防巨噬细胞泡沫化,进而降低动脉粥样硬化的发生.

目的 探讨病毒巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(vMIP-Ⅱ)对载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(APOBEC3G)表达的影响及其机制.方法 转染vMIP-Ⅱ质粒(vMIP-Ⅱ质粒组)、空质粒(空质粒组)至293T细胞.定量PCR和Western印迹法分析转染vMIP-Ⅱ基因对293T细胞APOBEC3G表达的影响.空质粒组、vMIP-Ⅱ质粒组细胞分别加入1 000 IU/ml干扰素α(IFN-α),培养36 h后,Western印迹法检测空质粒组、vMIP-Ⅱ质粒组、空质粒+IFN-α组、vMIP-Ⅱ质粒+IFN-oα组APOBEC3G的蛋白水平.对转染vMIP-Ⅱ质粒的293T细胞,分别用75μmol/L JAK/STAT信号通路抑制剂AG490和20 μmol/LERK信号通路抑制剂U0126处理,24h后收集细胞总蛋白,Western印迹法检测APOBEC3G蛋白水平.构建包含APOBEC3G启动子的荧光素酶报告基因重组质粒,启动子片段包括APOBEC3G全长启动子序列(POS)与长度1 560、960、720、480、420、360、330、240 bp序列及APOBEC3G启动子序列中不含调控元件的区域(NEG),将荧光素酶报告基因重组质粒和vMIP-Ⅱ质粒共转染293T细胞为实验组,以与空质粒共转染的293T细胞为对照,检测APOBEC3G启动子活性,分析vMIP-Ⅱ调控APOBEC3G转录活性的关键启动子作用区域.统计学比较采用t检验、单因素方差分析、LSD-t检验.结果 vMIP-Ⅱ转染组APOBEC3G mRNA、蛋白水平(2.500±0.013、1.472±0.013)均高于对照组(1、0.364±0.030,t值分别为6.22、6.54,均P＜0.05).空质粒组、vMIP-Ⅱ质粒组、空质粒+ IFN-α组、vMIP-Ⅱ质粒+IFN-α组APOBEC3G水平(分别为1、2.030±0.108、2.700±0.081、2.600±0.099)差异有统计学意义(F=67.026,P＜0.001),vMIP-Ⅱ质粒组与空质粒+IFN-α组差异无统计学意义(t=3.46,P＞0.05).vMIP-Ⅱ质粒组、vMIP-Ⅱ质粒+AG490组、vMIP-Ⅱ质粒+U0126组APOBEC3G水平(0.617±0.025、0.179±0.061、0.359±0.012)差异有统计学意义(F=70.019,P＜0.001),后两组均低于vMIP-Ⅱ质粒组(t值分别为9.66、11.836,P＜0.01).荧光素酶活性检测显示,转染了POS、1 560、960、720、480、420、360、330、240 bp及NEG序列的vMIP-Ⅱ质粒组启动子活性差异有统计学意义(F=81.092,P＜0.001),从720 bp片段至480 bp片段,APOBEC3G启动子活性降低幅度巨大.结论 vMIP-Ⅱ上调APOBEC3G的表达,可能是通过JAK/STAT信号通路或作用于APOBEC3G转录活性的关键启动子区域.

目的:通过构建和比较经Wnt5a基因修饰的巨噬细胞分别与骨髓干细胞(MSCs)2D单层贴壁与骨髓液跨小室共培养模型,旨在探索Wnt5a信号通过调控巨噬细胞炎症反应对MSCs成软骨分化产生的影响.方法:自2015年9月至2018年12月收集6例重度膝关节骨关节炎拟行全膝关节置换术者的巨噬细胞、MSCs和骨髓液,其中男2例,女4例;年龄58～71岁.膝关节囊滑膜组织常规消化取得单细胞,经反复贴壁并行Ficoll液密度梯度离心和抗CD14抗体流式细胞术测定巨噬细胞纯度.将上述经鉴定的巨噬细胞置于IFN-γ联合TNF-α刺激48 h后,再使用重组腺相关病毒(rAAV)-lacZ或Wnt5a转染24h,分别与MSCs 2D单层贴壁或骨髓液构建跨小室共培养模型,采用HE染色、软骨特殊染色、X-gal染色、抗Wnt5a、抗Ⅱ和Ⅹ型胶原免疫组化染色对细胞形态与增殖能力、病毒转粢效率和成软骨分化能力等进行检测.结果:抗CD68免疫组化显示骨关节炎患者滑膜组织巨噬细胞明显增多.抗CD14流式细胞术证实经分离的滑膜巨噬细胞纯度为90.31％,IFN-γ联合TNF-α刺激后发现上清液中单核细胞趋化素蛋白-1(MCP-1)水平明显升高,提示巨噬细胞被激活;rAAV-lacZ转染3d后,Ⅹ-gal染色发现其能有效转染巨噬细胞,效率高达97.50％,且至少持续21 d;rAAV-Wnt5a转染巨噬细胞后通过刺激其Wnt5a的表达,而增加两种模型中的Wnt5a表达,抑制MCP-1的分泌,两种模型中Wnt5a组MCP-1表达量分别为14.76和61.51 pg/ml;此外,rAAV-Wnt5a转染后能促进细胞增殖及成软骨分化、软骨基质合成.结论:在巨噬细胞与MSCs 2D单层贴壁或骨髓液跨小室共培养条件下,rAAV介导的Wnt5a过表达能通过影响巨噬细胞炎症反应而促进软骨稳态的维持以及MSCs成软骨分化,巨噬细胞可能通过Wnt5a信号影响软骨稳态与MSCs成软骨分化.

随着新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的出现和传播,国际社会正面临新的公共卫生危机.COVID-19主要通过吸入或接触感染者的飞沫传播,潜伏期为2～14天,主要症状为发热、咳嗽、咽痛、乏力、呼吸困难等,大多数患者症状较轻,而老年及存在基础疾病患者可能进展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和多脏器功能衰竭.ARDS是导致COVID-19患者死亡的主要原因[1].COVID-19通过S蛋白结合人体细胞表面的血管紧张素转化酶(ACE)2蛋白侵入人体细胞[2].新型冠状病毒主要分布在肺部的肺泡Ⅱ型上皮细胞、巨噬细胞、肺门淋巴结、脾脏和睾丸组织中,可导致炎症因子大量释放,形成全身炎症反应综合征(SIRS),引起肺、肝脏、心脏、肾、肾上腺等器官细胞坏死,最终导致多器官功能障碍综合征(MODS)[3-4].

严重急性呼吸综合征-冠状病毒-2 ( severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV)是近20 年来继严重急性呼吸综合征-冠状病毒( severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV )和中东呼吸综合征冠状病毒( Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)之后发现的第三种引起人类急性呼吸道疾病的冠状病毒[ 1-3].SARS-CoV-2感染导致的冠状病毒病( coronavirus disease 2019, COVID-19 )主要的病理生理学改变是病毒进入呼吸道后其表面的突刺蛋白(S蛋白)与支气管纤毛上皮、肺泡Ⅱ型上皮及毛细血管内皮细胞表面的血管紧张素转化酶 2 ( angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)受体结合,后者随后被宿主细胞的跨膜丝氨酸蛋白酶2 ( transmembrane protease serines 2, TMPRSS 2)剪切下来并胞吞入细胞内.病毒在胞内复制引起细胞死亡,导致上皮-内皮屏障被破坏,大量单核细胞和中性粒细胞浸润.巨噬细胞增殖释放炎症因子,因而诱导中性粒细胞聚集,加重肺损伤,出现内皮通透性增加、肺间质和肺泡水肿,肺泡内透明膜产生,并发急性呼吸窘迫综合征( acute respiratory distress syndrome, ARDS ).同时,SARS-CoV-2也可感染单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞及淋巴细胞,这一特征在细胞因子风暴的发生中也扮演重要角色[ 4-5].

目的 探讨结核分枝杆菌(Mtb)感染Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)来源外泌体(Exos)对巨噬细胞极化的影响.方法 实验1:体外培养AECⅡ和Mtb毒株H37Rv,用Mtb感染AECⅡ并分离Exos,分为AECⅡ组和Mtb-AECⅡ组;透射电子显微镜(TEM)和纳米粒子追踪分析(NTA)观察Exos形态,检测Exos的数量和大小;流式细胞术鉴定Exos表面特征标志物CD63、CD81和HSP70表达;BCA法检测Exos的蛋白质含量;miRNA微阵列检测2组间差异miRNA表达谱并进行验证;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6和IL-10水平.实验2:将AECⅡ分为对照组、mimic-NC组、miR-145 mimic组、inhibitor-NC组、miR-145 inhibitor组,用过表达或沉默miR-145的慢病毒转染AECⅡ后用Mtb感染并分离Exos,实时荧光定量PCR(qPCR)检测转染后Mtb-AECⅡExos中miR-145水平;流式细胞术检测巨噬细胞M1型标志物(CD86)、M2型标志物(CD163)表达;qPCR检测巨噬细胞中miR-145、TNF-α、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(Arg-1)和IL-10的mRNA水平.结果 实验1:Mtb感染的AECⅡ分泌Exos为球形囊泡,直径约为100 nm;Exos中CD63、CD81、HSP70均呈阳性;与AECⅡ组相比,Mtb-AECⅡ组中Exos的数量和蛋白质含量、miR-145、IL-10水平增加(P<0.05),TNF-α和IL-6水平降低(P<0.05).实验2:与对照组相比,miR-145 mimic组Mtb-AECⅡExos中miR-145水平、CD163阳性巨噬细胞百分比及巨噬细胞中miR-145、Arg-1和IL-10 mRNA水平升高(P<0.05),CD86阳性巨噬细胞百分比、巨噬细胞中TNF-αmRNA、iNOS mRNA水平降低(P<0.05),miR-145 inhibitor组上述指标的变化与miR-145 mimic组相反.结论 Mtb感染AECⅡ来源Exos可能通过miR-145刺激巨噬细胞向M2型极化并抑制M1型极化,对抗炎症.

该文旨在研究抗菌肽Aoattacin对皮肤烫伤模型小鼠创伤愈合的影响.采用重组杆状病毒表达系统在昆虫sf9细胞中对Aoattacin蛋白进行表达和纯化,并通过构建深Ⅱ度烧伤小鼠模型来检测其对烧伤创面愈合的影响:实验组滴注抗菌肽1次/天(25mg/L),以PBS(30mg/L)为阴性对照,磺胺嘧啶银(10 mg/L)为阳性对照.通过测量烫伤后皮肤损伤面积计算伤口愈合率(第7、14、21天),同时取小鼠烫伤处和周边皮肤进行HE染色,通过形态学变化分析创面病理组织结构并利用免疫组化法测定EGF、bFGF变化情况.文中表达、纯化了具有抑菌活性的抗菌肽Aoattacin,伤后7天和对照组相比,抗菌肽组小鼠创面菌落数减少,差异显著(P＜0.01);抗菌肽组小鼠损伤皮肤愈合率高于对照组(P＜0.05),这与其可降低炎症反应(低中性粒细胞和巨噬细胞浸润和促炎细胞因子水平)有关.与对照组相比,抗菌肽组的小鼠创面新生组织的毛细血管、成纤维细胞数量均有增多,14、21天时组织分层明显;抗菌肽组的EGF、bFGF表达在两个时间点明显超过对照组(P＜0.05).结果表明,抗菌肽Aoattacin可抑制模型小鼠的创面感染、对创面愈合及修复过程都有促进作用,具有开发成为烧伤药物的潜力.

目的:探究过表达沉默信息调节因子1(SIRT1)对脓毒症诱导的急性肺损伤(ALI)巨噬细胞表型转化的影响及调控机制.方法:体外培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7,LPS+IFN-γ与IL-4定向诱导其M1与M2型极化,Western blot检测细胞SIRT1和M1型标志物iNOS、CD86与M2型标志物Arg1、Mcr1蛋白表达.转染过表达SIRT1的质粒,RT-PCR检测转染效率,LPS诱导脓毒症ALI体外细胞模型,并分为4组:LPS组、LPS+pcDNA3.1-SIRT1组、LPS+pcDNA3.1-NC组和Control组,Western blot检测各组细胞iNOS、CD86与Arg1、Mcr1和自噬标志物LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1与p62及SIRT1/FOXO1信号通路SIRT1、FOXO1蛋白表达.免疫荧光检测各组细胞LC3B荧光表达.采用盲肠结扎穿孔(CLP)术构建脓毒症ALI小鼠模型,通过慢病毒在小鼠体内过表达SIRT1,并分为4组:假手术(Sham)组、CLP组、CLP+LV-NC组、CLP+LV-SIRT1组,RT-PCR、HE染色、ELISA检测各组小鼠肺组织SIRT1 mRNA表达、病理损伤及支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎症因子TNF-α、IL-6与IL-10分泌,记录并分析造模72 h后各组小鼠存活率.结果:体外成功诱导了RAW264.7细胞M1、M2型极化,且M1型巨噬细胞SIRT1蛋白表达明显降低(P<0.05),而M2型巨噬细胞SIRT1表达显著升高(P<0.05).转染pcDNA3.1-SIRT1后细胞SIRT1 mRNA表达明显升高(P<0.05).与LPS组或LPS+pcDNA3.1-NC组相比,LPS+pcDNA3.1-SIRT1组iNOS、CD86、p62蛋白表达显著降低(P<0.05),而Arg1、Mcr1、LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1、SIRT1、FOXO1表达明显升高(P<0.05),LC3B荧光斑点数显著增加(P<0.05).小鼠体内实验显示,与CLP组或CLP+LV-NC组相比,CLP+LV-SIRIT1组SIRT1 mRNA表达、BALF中抗炎因子IL-10分泌和造模72 h后小鼠存活率均明显升高(P<0.05),而肺组织病理损伤、BALF中促炎因子TNF-α、IL-6水平显著降低(P<0.05).结论:过表达SIRT1可在体内外改善脓毒症ALI,而通过SIRT1/FOXO1通路提高自噬水平促进巨噬细胞M2型极化可能是其发挥保护作用的机制之一.