目的:探究百里醌(thymoquinone,TQ)抑制NLRP3炎症小体对帕金森病(parkinson's disease,PD)模型神经炎性损伤的干预机制.方法:体内实验建立1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶诱导的PD小鼠模型,随机分为对照组、对照+TQ组、模型组、模型+TQ组;采用旷场、转棒实验评估TQ对PD小鼠运动缺陷的影响;Western blot法检测TQ对PD小鼠中脑组织酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)和NLRP3炎症小体表达的影响.体外实验用脂多糖和 1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)先后诱导小胶质细胞(BV-2),收集细胞上清作为条件培养液,作用于人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞,构建PD神经炎性损伤模型.采用MTT法测定TQ和MPP+干预的最适浓度,以及各干预组细胞的存活率;TUNEL染色检测细胞凋亡情况;Western blot法检测TQ处理后SH-SY5Y细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达情况;ELISA检测IL-1β水平;Western blot法分析经TQ作用后BV-2细胞NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1、Tubulin蛋白的表达.结果:模型组小鼠的运动功能显著低于对照组(P<0.01),TQ组小鼠的运动功能显著高于模型组(P<0.01);Western blot结果显示,与对照组相比,模型组α-Syn水平显著增加(P<0.01);与模型组小鼠相比,TQ显著降低了PD小鼠脑内α-Syn的表达水平(P<0.01);与模型组相比,TQ给药后,TH蛋白表达显著增加(P<0.01).进一步研究发现,TQ抑制PD小鼠NLRP3、Caspase-1、IL-1β、ASC蛋白表达的上调(P<0.01).MTT检测发现,100 μmol/LMPP+对条件培养SH-SY5Y细胞的增殖有显著抑制作用,TQ干预后可减轻SH-SY5Y细胞损伤(P<0.01).TUNEL染色结果显示,MPP+条件培养液作用SH-SY5Y细胞导致凋亡发生,TQ预处理后可显著降低细胞凋亡率(P<0.01).Western blot检测发现Bcl-2/Bax的表达在MPP+条件培养液后显著下调,而TQ可以促进Bcl-2/Bax比值的表达.同时,条件培养液引起SH-SY5Y细胞Caspase-3 的激活,TQ预处理可降低MPP+诱导的Caspase-3蛋白表达(P<0.01).ELISA检测发现TQ可显著抑制MPP+诱导的IL-1β分泌(P<0.01).Western blot结果显示,TQ抑制MPP+诱导BV-2细胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β、ASC蛋白表达的上调(P<0.01).结论:TQ通过抑制PD模型NLRP3炎症小体激活,缓解PD模型神经元的炎性损伤,进而对多巴胺能神经元起到保护作用.

目的 观察百里醌(TQ) 联合5-氟尿嘧啶(5-Fu) 诱导对胃癌HGC-27细胞发生增殖和凋亡的影响.方法 于2015年9月—2017年8月在武汉大学中心实验室进行实验,以TQ 50 μmol/L(TQ组)、5-Fu 75 μg/ml(5-Fu组)及 TQ 50 μmol/L + 5-Fu 75 μg/ml(联合组)刺激胃癌HGC-27细胞24 h后,CCK-8检测其对增殖的影响,Hoechst染色、流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质印迹法分析凋亡相关蛋白 Bax和Bcl-2的表达.结果 CCK-8结果显示,百里醌可抑制胃癌HGC-27细胞的增殖,联合组对细胞的抑制率高于5-Fu组及TQ组( F =767.05,P<0.01).Hoechst结果显示,联合组的凋亡率明显高于5-Fu组.流式细胞仪检测显示,对照组的凋亡率为(2.26 ± 0.17)%,TQ组、5-Fu组及联合组的凋亡率分别为(3.76 ± 0.44)%、(6.24 ± 0.19)%及(9.76 ± 0.25)%,联合组的凋亡率高于TQ组和5-Fu组( F =449.58,P<0.01).蛋白质印迹法结果显示,联合组的促凋亡蛋白Bax表达量均较(TQ组或5-Fu组)升高( F =58.803,P<0.01),且抑凋亡蛋白Bcl-2较TQ组或5-Fu组降低( F =67.203, P<0.01).结论 百里醌联合5-氟尿嘧啶可抑制胃癌HGC-27细胞增殖并促进其凋亡,百里醌可增加胃癌HGC-27细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性.

目的 研究百里醌对大鼠蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后脑细胞凋亡的作用及其机制.方法 采用血管内穿刺法建立SAH模型,将48只成年雄性SD大鼠采用数字表法随机分为假手术组(Sham组)、SAH组、媒介组和百里醌组,SAH造模24h后检测神经功能损伤、脑组织含水率和脑组织内依文蓝(EB)含量;Tunel法检测脑细胞凋亡;ELISA法检测脑组织中IL-13的表达;Western blot法检测脑组织中IL-13Rα2、p-PI3K、p-AKT和mTOR的表达.结果 SAH组大鼠Garcia神经功能评分、脑组织含水率和EB含量较Sham组均明显升高,脑组织中IL-13的表达上调;SAH组大鼠脑出血后细胞凋亡率显著上升,IL-13Rα2、p-PI3K、p-AKT和mTOR的表达升高;与媒介组相比较,百里醌组大鼠Garcia神经功能评分、脑组织含水率和EB含量均明显降低,IL-13在脑组织中的表达下调,细胞凋亡率显著下降,IL-13Rα2、p-PI3K、p-AKT和mTOR的表达下调.结论 百里醌可减轻大鼠SAH后脑损伤和脑细胞凋亡,其机制可能通过IL-13Rα2/PI3K/AKT/mTOR通路实现.

目的 探讨百里醌(TQ)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞毒性作用的分子机制.方法 NSCLC鳞癌细胞SK-MES-1接种于96孔板,予20、40、60、80、100 μmol/L TQ培养24 h,观察浓度依赖性,计算TQ的IC50值;予接近IC50浓度TQ培养SK-MES-1,观察时间依赖性;予ERK抑制剂U0126和p38抑制剂SB203580分别作用于SK-MES-1、95-D,观察细胞存活率;Western blot检测U0126预处理1h,加TQ孵育SK-MES-1 30 min后测p-p38、p38,p-ERK1/2、ERK1/2,p-JNK、JNK蛋白表达.结果 ①TQ呈浓度和时间依赖性降低NSCLC细胞存活率;②30 μmol/L TQ和10 μmol/L U0126 +30μmol/L TQ比较其细胞存活率有显著差异(P =0.000),但与10 μmol/L SB203580 +30μmol/L TQ比较无显著差异(P=1.00),10 μmol/L SB203580+ 30 μmol/L TQ与10 μmol/L U0126+ 30 μmol/L TQ组比较有显著差异(P =0.000);60 μmol/L TQ、10 μmol/L U0126+60 μmol/L TQ、10 μmol/L SB203580 +60μmol/L TQ两两比较均无显著差异(P＞0.05);随TQ浓度增加,SB203580对95-D细胞的保护作用逐渐减弱,10μmol/L SB203580+ 40μmol/L TQ组与40 μmol/L TQ组比较细胞存活率仍有显著差异(P=0.033);③Western blot结果表明U0126显著抑制ERK1/2磷酸化,p38随TQ浓度增加而磷酸化增加,但ERK 1/2磷酸化减少,JNK磷酸化无明显改变.结论 TQ透过磷酸化p38途径介导NSCLC毒性作用,而不是ERK1/2途径.

目的 观察百里醌对大鼠肾缺血再灌注损伤(ischemia-reper fusion injury,IRI)的保护作用.方法 60只健康SD大鼠,♂,随机分成正常组、模型组和百里醌组.模型组和百里醌组大鼠建立肾脏缺血再灌注模型,百里醌组在再灌注同时腹腔注射百里醌(40 mg·kg-1).HE染色观察肾脏组织病理改变;测定血清指标肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)以及肾组织指标丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD);采用原位缺口末端标记检测肾小管上皮细胞凋亡指数(AI);RT-PCR检测肾脏组织中的caspase-3,Bax和TNF-α和IL-1β的表达情况.结果 模型组可见肾小管扩张,肾小管上皮细胞坏死等,经百里醌治疗后明显改善.与模型组相比,百里醌组凋亡指数明显降低(P＜0.05).与正常组比较,模型组SOD活性显著降低(P＜0.05),MDA含量、Scr和BUN显著升高(P＜0.05);与模型组比较,百里醌组SOD活性显著升高(P＜0.05),MDA含量、Scr和BUN显著降低(P＜0.05);与正常组比较,模型组中caspase-3、Bax、TNF-α和IL-1β mRNA表达水平明显增高(P＜0.05).和模型组比较,百里醌组中caspase-3、Bax、TNF-α和IL-1β表达明显减低(P＜0.05).结论 百里醌可减轻氧化应激水平,发挥抗炎及抗凋亡作用,从而在肾脏IRI过程中发挥保护作用.

目的 探讨百里醌(TQ)是否增强吉非替尼对EGFR-L858R/T790M突变的H1975细胞的毒性作用.方法 人类非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系95-D、A549、SK-MES-1、H1299、H1975,正常肝脏细胞系HL7702和正常气道上皮细胞系BEAS-2B,按1×104/孔,接种于96孔板,予20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L TQ培养24 h,MTT测细胞存活率,筛选对TQ敏感的细胞系.筛选细胞后比较TQ、顺铂、吉非替尼三种药物72 h的细胞存活率,评价TQ联合顺铂,或者TQ联合吉非替尼对筛选细胞系的毒性增敏作用.结果 TQ对95-D和H1975细胞系比较敏感;培养72 h后,TQ对95-D细胞的毒性作用不优于顺铂和吉非替尼,但在H1975细胞中TQ毒性优于顺铂,但劣于吉非替尼,TQ组和TQ+吉非替尼组的细胞存活率比较差异无统计学意义(P>0.05);Chou-Talalay公式计算表明TQ和吉非替尼既无相加也无协同作用.结论 TQ联合吉非替尼治疗不增加EGFR-L858R/T790M突变H1975细胞系的细胞毒性作用.

目的 观察百里醌对大鼠肠缺血再灌注损伤(IIRI)的保护作用.方法 45只健康雄性SD大鼠,随机分成3组:假手术对照组(A组)、肠缺血再灌注组(B组)和肠缺血再灌注十百里醌组(C组).B组和C组分别建立大鼠肠缺血再灌注模型,C组在再灌注同时腹腔注射百里醌(50mg/kg).方法 HE染色观察小肠组织形态学改变;测定丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)含量;采用原位缺口末端标记检测肠黏膜上皮细胞凋亡指数(AI);RT-PCR检测小肠组织中的caspase-3、Bax和Bcl-2的表达情况.结果 B组可见肠绒毛排列紊乱,肠黏膜坏死等表现,经百里醌治疗后明显改善;A组、B组和C组的凋亡指数分别为(4.53±0.28)％、(21.73±1.17)％、(9.53±0.96)％,SOD活性分别为(135.37±3.34)、(76.45±1.39)和(95.13±1.64) U/mg蛋白,MDA含量分别为(2.83±0.36)、(9.23±0.78)和(4.97±0.45) nmol/mg蛋白;与A组比较,B组中Bax、caspase-3 mRNA表达水平明显增高,Bcl-2表达水平降低(P＜0.05).与B组比较,C组中Bcl-2表达水平增高,Bax、caspase-3表达水平减低(P＜0.05).结论 百里醌可减轻氧化应激水平,发挥抗凋亡作用,从而在肠IIRI过程中发挥保护作用.

目的:探讨百里香醌(TQ)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠心肌纤维化(MF)的保护作用及其可能机制.方法:将40只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、模型组和TQ低、高剂量组[5、10 mg/(kg·d)],每组10只.除对照组大鼠腹腔注射等体积生理盐水外,其余各组大鼠均腹腔注射LPS复制MF模型,每天1次,连续3周.自造模第1天起,各给药组大鼠均腹腔注射相应药物,每天1次,连续3周.末次给药后,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组大鼠血清炎症因子[白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)]含量;称定并计算其心脏质量参数[心脏质量指数(HW/BM)、左心室质量指数(LVW/BW)];采用苏木精-伊红染色法观察其心肌组织病理学变化;采用化学分析法、黄嘌呤氧化酶法或酶联免疫吸附法检测其心肌组织中氧化应激指标[丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)]和心肌胶原指标[羟脯氨酸(HYP)、Ⅰ型胶原蛋白(Col-Ⅰ)、Col-Ⅲ]含量或活性;采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测其MF相关调控基因[Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、基质金属蛋白酶3(MMP-3)、MMP-9、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad3]的mRNA表达情况.结果:与对照组比较,模型组大鼠心肌细胞肿胀,细胞核大小不一且排列紊乱,纤维增生明显;血清炎症因子含量,LVW/BW,心肌组织MDA、HYP、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ含量以及Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1、Smad3的mRNA相对表达量均显著升高(P<0.05),SOD活性显著降低(P<0.05).与模型组比较,TQ各剂量组大鼠MF程度均有不同程度的改善;TQ低剂量组大鼠血清IL-1β含量,心肌组织MDA、HYP、Col-Ⅰ含量,TQ高剂量组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量,LVW/BW,心肌组织MDA、HYP、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ含量以及TQ各剂量组Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1的mRNA相对表达量均显著降低(P<0.05);TQ各剂量组心肌组织SOD活性显著升高(P<0.05).其余指标组间比较差异均无统计学意义(P>0.05).结论:TQ对MF模型大鼠具有一定的保护作用,其作用机制可能与抑制炎症反应和氧化应激反应,下调Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1的mRNA表达有关.

目的 探讨百里醌作用于PTEN/AKT信号通路抑制大鼠平滑肌细胞增殖和迁移的影响,进一步深入了解其可能的作用机制.方法 选取250～300g SD雄性大鼠分离并培养颈动脉平滑肌细胞,按照干预措施可分为空白对照组、低剂量百里醌组(1mg/L)、中剂量百里醌组(10mg/L)和高剂量百里醌组(100mg/L),百里醌各剂量组细胞用相应剂量的百里醌组进行干预.划痕实验观察平滑肌细胞迁移情况,MTT法、α-SMA和PCNA免疫组织化学染色检测颈动脉平滑肌细胞增殖情况,TUNEL染色检测颈动脉平滑肌细胞的凋亡情况,Western blot检测PTEN、P-AKT、AKT、Bax和bcl-2蛋白的表达量.结果 与空白对照组比较,百里醌各剂量组迁移面积减小,OD值降低,α-SMA和PCNA表达阳性率降低,PTEN和Bax蛋白的表达量升高,P-AKT、AKT和Bcl-2蛋白的表达量降低,以上结果差异均有统计学意义(P<0.05).百里醌各剂量之间比较,随着剂量增大,迁移面积减小,OD值降低,α-SMA和PCNA表达阳性率降低,PTEN和Bax蛋白的表达量升高,P-AKT、AKT和Bcl-2蛋白的表达量降低,以上结果差异均有统计学意义(P<0.05).与其他组比较,高剂量百里醌组细胞凋亡率明显升高(P<0.05).结论 百里醌能够抑制平滑肌细胞增殖和迁移,其作用机制与PTEN/AKT信号通路有关.

目的 探究百里醌降低过氧化氢引起的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞凋亡及其潜在机制.方法 使用百里醌预处理HUVECs细胞后加入过氧化氢共培养1 h,使用四甲基偶氮唑蓝(MTT)方法测定细胞增殖能力改变;应用流式细胞仪检测百里醌预处理后加入过氧化氢共培养的HUVECs细胞凋亡情况变化;使用GFP-LC3荧光体系检测百里醌对HU-VECs细胞自噬的影响;应用Western印迹法测定不同处理后HUVECs细胞Caspase-3/Cleaved Caspase-3、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、Akt/p-Akt、mTOR/p-mTOR、Beclin1、Bcl-2、β-Actin蛋白表达情况改变.结果 百里醌预处理HUVECs细胞,降低由过氧化氢引起的细胞凋亡并呈现剂量依赖性(P<0.05);百里醌诱导HUVECs细胞发生自噬;3-MA阻断自噬途径后百里醌对过氧化氢处理的HUVECs细胞保护作用减弱(P<0.05);百里醌抑制p-Akt、p-mTOR蛋白表达,促进Beclin1和Bcl-2蛋白表达(P<0.05).结论 百里醌通过抑制Akt/mTOR信号通路和上调Beclin1蛋白激活自噬,促进Bcl-2蛋白表达抑制凋亡,降低过氧化氢引起的HUVECs细胞凋亡,为动脉粥样硬化的防治提供新思路.