目的:观察吡咯并喹啉醌(PQQ)在氧化应激条件下对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)线粒体功能和细胞存活的影响，并探讨其作用机制。方法:体外用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(下称正常培养基)培养大鼠BMSC，选取对数生长期的第3～5代细胞进行实验。(1)取细胞，分为正常对照组、正常对照＋PQQ组、单纯过氧化氢组、过氧化氢＋PQQ组。正常对照组细胞用正常培养基培养24 h；正常对照＋PQQ组细胞用含终物质的量浓度为100 μmol/L PQQ的正常培养基培养24 h；单纯过氧化氢组细胞用含有终物质的量浓度为200 μmol/L过氧化氢的正常培养基培养24 h；过氧化氢＋PQQ组细胞用含有终物质的量浓度为100 μmol/L PQQ的正常培养基培养2 h后，加入终物质的量浓度为200 μmol/L的过氧化氢培养24 h。于倒置相差显微镜下观察各组细胞形态，采用细胞计数试剂盒8法检测细胞存活率。(2)取5个批次细胞，均分为正常对照组、单纯过氧化氢组、过氧化氢＋PQQ组，各组细胞处理同实验(1)中相应各组。培养24 h后，采用流式细胞术对1个批次细胞进行细胞凋亡检测，计算细胞凋亡率；采用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒和倒置相差荧光显微镜对1个批次细胞分别进行线粒体膜电位检测和JC-1荧光染色观察；采用透射电镜观察1个批次细胞线粒体形态；采用过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性测定试剂盒对1个批次细胞分别进行CAT和SOD活性检测；采用蛋白质印迹法对1个批次细胞环磷酸腺苷活化交换蛋白1(Epac1)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、磷酸化AMPK、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、caspase-3蛋白表达进行检测，计算AMPK磷酸化水平、剪切型caspase-3/caspase-3比值。除形态观察外，其余各指标每组样本数均为6。对数据行单因素方差分析、独立样本等方差 t检验。 结果:(1)培养24 h后，单纯过氧化氢组细胞出现空泡且数量较正常对照组减少，细胞存活率为(74.3±2.9)%，较正常对照组的100.0%明显降低( t＝6.39， P<0.01)；与单纯过氧化氢组比较，过氧化氢＋PQQ组细胞形态明显改善，细胞存活率明显升高至(116.9±4.2)%( t＝6.92， P<0.01)；正常对照＋PQQ组细胞存活率为(101.2±1.1)%，与正常对照组相近( t＝1.06， P>0.05)。(2)培养24 h后，与正常对照组的(13.6±1.0)%比较，单纯过氧化氢组细胞凋亡率明显增加[(37.1±2.0)%， t＝10.57， P<0.01]；与单纯过氧化氢组比较，过氧化氢＋PQQ组细胞凋亡率明显降低[(17.0±0.7)%， t＝9.49， P<0.01]。(3)培养24 h后，与正常对照组比较，单纯过氧化氢组细胞线粒体膜电位出现去极化，JC-1荧光染料主要以单体形式存在于细胞质中，发出绿色荧光，表现为膜电位明显降低( t＝4.18， P<0.01)；与单纯过氧化氢组比较，过氧化氢＋PQQ组细胞线粒体膜电位升高至正常水平( t＝4.43， P<0.01)，JC-1荧光染料顺着极化线粒体膜电位进入线粒体聚集，发出红色荧光。(4)培养24 h后，与正常对照组的规则形态比较，单纯过氧化氢组细胞线粒体结构紊乱，线粒体嵴消失，线粒体基质密度降低；与单纯过氧化氢组比较，过氧化氢＋PQQ组细胞线粒体结构规则完整，线粒体嵴清晰可见，线粒体基质密度增加。(5)培养24 h后，与正常对照组比较，单纯过氧化氢组细胞CAT活性明显升高( t＝4.54， P<0.05)，SOD活性明显降低( t＝3.93， P<0.05)；与单纯过氧化氢组比较，过氧化氢＋PQQ组细胞CAT活性明显上升( t＝8.65， P<0.01)，SOD活性无明显变化( t＝0.72， P>0.05)。(6)培养24 h后，与正常对照组比较，单纯过氧化氢组细胞Epac1蛋白表达明显降低( t＝4.67， P<0.01)，AMPK磷酸化水平、剪切型caspase-3/caspase-3比值明显升高( t＝7.88、3.62， P<0.01)；与单纯过氧化氢组比较，过氧化氢＋PQQ组细胞Epac1蛋白表达、AMPK磷酸化水平均明显升高( t＝4.34、16.37， P<0.01)，剪切型caspase-3/caspase-3比值明显降低( t＝3.17， P<0.05)。 结论:PQQ预处理能够改善氧化应激条件下大鼠BMSC的线粒体功能，降低细胞凋亡率，提高细胞存活率，且可能与Epac1蛋白表达上调、AMPK信号通路激活和剪切型caspase-3蛋白水平降低有关。

许多儿科疾病都与低氧密切相关。低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)是一种氧平衡调节中的关键因子，其表达水平主要受氧浓度的影响。在机体适应慢性低氧的过程中，不仅可以通过HIF及其介导的下游信号通路改变对低氧的应答，也可以通过调节整体甲基化或组蛋白修饰水平等表观遗传修饰以适应低氧环境。既往研究表明，HIF的转录活性和稳定性与包括甲基化/去甲基化、羟基化、去乙酰化、磷酸化以及乳酸化在内的多种组蛋白修饰相互关联。HIF与表观遗传修饰相关性的研究值得深入探索，是调节HIF表达水平的重要潜在靶点。

目的:探讨组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂CG200745对链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病幼鼠胰岛β细胞的作用及其可能的机制。方法:40只Sprauge-Dawley(SD)幼鼠随机分为空白对照组、糖尿病组、CG低剂量组和CG高剂量组，每组各10只。除空白对照组外，其余组幼鼠腹腔注射STZ50 mg/kg建立糖尿病模型。CG低、高剂量组分别腹腔注射CG200745 1.25 mg/(kg·d)和5.0 mg/(kg·d)，空白对照组和糖尿病组腹腔注射等量生理盐水。持续给药3周后，测定幼鼠体重、胰腺重量、血糖和血浆胰岛素水平；苏木精-伊红(HE)染色法检测胰腺病理组织学变化；免疫组织化学染色检测胰岛素和增殖细胞核抗原(PCNA)表达；原位末端转移酶标记(TUNEL)染色检测胰岛β细胞凋亡率；应用蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测胰腺组织的组蛋白3(H3)、组蛋白乙酰化H3(Ac-H3)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB或Akt)通路蛋白表达水平。结果:与空白对照组相比，糖尿病组幼鼠胰腺组织中胰岛β细胞数量明显减少，且分布不均匀，排列紊乱，体重、胰腺重量和血浆胰岛素水平降低( P均<0.05)，胰腺胰岛素、PCNA和Ac-H3/H3表达降低( P均<0.05)，血糖水平、胰岛β细胞凋亡率升高( P均<0.05)，胰腺磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)/PI3K和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)/Akt蛋白比值降低；与糖尿病组相比，CG低、高剂量组幼鼠胰岛β细胞数量增多，且分布和排列趋于规整，体重、胰腺重量和血浆胰岛素水平明显升高( P均<0.05)，胰腺胰岛素、PCNA和Ac-H3/H3表达升高( P均<0.05)，血糖水平、胰岛β细胞凋亡率降低( P均<0.05)，胰腺p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白比值升高。 结论:HDAC抑制剂CG200745对糖尿病幼鼠胰岛β细胞具有保护作用。

目的:探讨交感神经递质去甲肾上腺素(NE)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)迁移的影响及其机制。方法:(1)取20只3周龄雄性C57BL/6小鼠，处死后取出股骨和胫骨，分离培养BMSC并鉴定。取第2代或3代细胞，分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、1 μmol/L NE组、10 μmol/L NE组及100 μmol/L NE组，每组8孔。1 μmol/L NE组、10 μmol/L NE组及100 μmol/L NE组细胞分别在含体积分数1%胎牛血清的低糖DMEM培养基(以下简称低血清培养基)内分别加入终物质的量浓度为1、10、100 μmol/L的NE培养，PBS组细胞在低血清培养基内加入等体积的PBS培养。在刺激前(0 d)及刺激1、3、5 d，采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖活性(以吸光度值表示)。(2)细胞划痕试验1中，取细胞分为PBS组和单纯NE组，行划痕试验后，单纯NE组细胞采用低血清培养基＋终物质的量浓度为10 μmol/L的NE培养，PBS组细胞采用低血清培养基＋等体积PBS培养。细胞划痕试验2中，取细胞分为PBS组、普萘洛尔＋NE组、酚妥拉明＋NE组，行划痕试验后，普萘洛尔＋NE组细胞每天采用低血清培养基＋终物质的量浓度为1 μmol/L的普萘洛尔、酚妥拉明＋NE组细胞每天采用低血清培养基＋终物质的量浓度为10 μmol/L的酚妥拉明预处理30 min后，均再采用低血清培养基＋终物质的量浓度为10 μmol/L的NE培养；PBS组采用低血清培养基＋等体积PBS培养。细胞划痕试验3中，取细胞分为单纯NE组、单纯(2E，6E)-2，6-二(4-吡啶基亚甲基)环己酮(SC-66)组、SC-66＋NE组，行划痕试验后，单纯NE组采用低血清培养基＋终物质的量浓度为10 μmol/L的NE培养；单纯SC-66组细胞每天采用终物质的量浓度为30 mmol/L的SC-66预处理30 min后，再采用低血清培养基培养；单纯SC-66＋NE组每天采用终物质的量浓度为30 mmol/L的SC-66预处理30 min后，再采用低血清培养基＋终物质的量浓度为10 μmol/L的NE培养。以上3个细胞划痕试验，每组样本数均为6，均计算划痕后24、48、72 h的划痕愈合率。(3)取细胞分为PBS组、单纯NE组、普萘洛尔＋NE组、酚妥拉明＋NE组，每组3孔，PBS组、单纯NE组下室处理分别同细胞划痕试验1相同组，普萘洛尔＋NE组和酚妥拉明＋NE组下室处理分别同细胞划痕试验2相同组，行Transwell实验。常规培养24 h后，计数迁移细胞。(4)取细胞分为PBS组、单纯NE组、普萘洛尔＋NE组、酚妥拉明＋NE组，每组2皿，PBS组、单纯NE组细胞处理分别同细胞划痕试验1相同组，普萘洛尔＋NE组和酚妥拉明＋NE组细胞处理分别同细胞划痕试验2相同组。常规培养24 h后，采用蛋白质印迹法检测细胞蛋白激酶B(Akt)磷酸化水平。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、独立样本 t检验、LSD- t检验、Bonferroni校正。 结果:(1)刺激1 d，100 μmol/L NE组细胞吸光度值明显低于PBS组( t＝2.986， P<0.05)；刺激5 d，10 μmol/L NE组细胞吸光度值明显高于PBS组( t＝3.547， P<0.01)。(2)细胞划痕试验1中，划痕后24、48、72 h，单纯NE组细胞划痕愈合率分别为(34.4±3.4)%、(52.5±4.7)%、(70.0±3.8)%，明显低于PBS组的(44.1±4.2)%、(80.0±3.6)%、(95.9±2.2)%( t＝19.320、128.319、221.575， P<0.01)。细胞划痕试验2中，划痕后24、48、72 h，普萘洛尔＋NE组细胞划痕愈合率均明显低于PBS组( t＝4.073、9.618、15.272， P<0.01)。细胞划痕试验3中，划痕后72 h，单纯NE组细胞划痕愈合率明显低于单纯SC-66组( t＝8.862， P<0.01)；划痕后24、48、72 h，SC-66＋NE组细胞划痕愈合率均明显低于单纯SC-66组( t＝3.862、4.290、10.357， P<0.01)。(3)Transwell实验显示，培养24 h，单纯NE组、普萘洛尔＋NE组及酚妥拉明＋NE组细胞迁移数量均明显少于PBS组( t＝11.895、10.196、3.222， P<0.01)。(4)培养24 h后，与PBS组比较，单纯NE组、普萘洛尔＋NE组细胞Akt磷酸化水平明显升高( t＝8.186、5.996， P<0.01)。 结论:NE可抑制小鼠BMSC迁移，Akt信号通路参与了此调控过程。

背景 蛋白磷酸酶 4(protein phosphatase 4,PP4)的去磷酸化作用是调节细胞增殖、凋亡、分化和其他重要功能的机制之一,PP4在非酒精性脂肪性肝病中的调节作用尚不明确.目的 研究PP4在脂质沉积肝细胞的脂代谢、损伤及凋亡中的作用.方法 以小鼠肝细胞AML12为研究对象,分为对照组、PP4抑制剂处理组、油酸处理组和油酸+PP4抑制剂组,利用分光光度法检测三酰甘油(triglyceride,TG)及转氨酶[丙氨酸转氨酶(alanine transaminase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspart-ate transaminase,AST)]含量,流式细胞术检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)、细胞周期、细胞凋亡,qPCR检测脂质代谢及凋亡基因表达情况.以AML12小鼠肝细胞PP4过表达系为研究对象,分为对照组、PP4过表达组、PP4干扰组、油酸处理组和PP4过表达+油酸处理组,qPCR检测脂质代谢关键酶基因表达情况,油红O染色法检测脂质蓄积情况,Western blot技术检测脂质代谢关键酶蛋白表达情况,探索PP4对脂质蓄积肝细胞脂质代谢、损伤及凋亡的影响.结果(1)与对照组相比,油酸处理组肝细胞PP4、肝纤维化基因Timp1、抗凋亡基因Bcl-2、凋亡基因Bax、凋亡基因Caspase 3表达水平升高(P＜0.05),脂代谢关键酶基因CPT1、ACC1、FAS表达水平升高(P＜0.05);TG、ALT、AST升高(P＜0.05);ROS阳性细胞百分比增加(P＜0.001),G0/G1期细胞占比减少(P＜0.01),S期增加(P＜0.05),细胞凋亡增加(P＜0.001).(2)与单纯油酸处理组相比,油酸+PP4抑制剂处理组肝纤维化基因Cola1、凋亡基因Bax、凋亡基因Caspase 3表达水平降低(P＜0.05);脂代谢关键酶基因ACC1、FAS表达水平降低(P＜0.05);ALT、AST降低(P＜0.05);ROS阳性细胞百分比减少(P＜0.05),细胞G0/G1期占比增加(P＜0.01),S期减少(P＜0.05),细胞凋亡降低(P＜0.001).(3)PP4干扰后脂代谢关键酶基因CPT1、FAS表达水平降低(P＜0.05),PP4过表达后脂代谢关键酶基因CPT1、FAS表达水平升高(P＜0.05);PP4过表达加油酸处理后与对照组加油酸处理后油红O染色显示脂质沉积增加(P＜0.05);油酸处理后脂代谢关键酶蛋白PP4、ACC1表达升高,CPT1表达下降(P＜0.05).结论 PP4参与油酸处理肝细胞脂质代谢、损伤及凋亡,抑制PP4活性能够减少肝细胞脂质蓄积,PP4过表达脂质蓄积增加.

目的:探究以成纤维细胞生长因子受体(FGFR)非对称二聚化模型为结构基础设计成纤维细胞生长因子19(FGF19)的非促肿瘤型改构体,并对其增殖活性和代谢活性进行评估,使其成为治疗胆汁淤积症的候选药物之一.方法:利用pymol软件分析蛋白晶体结构并设计FGF19改构体,将构建好的FGF19改构体(FGF19F159A)与FGF19野生型(FGF19WT)的质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中,经过诱导表达、变性、复性获得正确构象的蛋白,经过镍柱亲和层析与分子排阻色谱方法纯化得到目的蛋白;通过蛋白邻位连接技术(PLA)对比FGF19WT和FGF19F159A诱导受体二聚化的程度;MTT实验检测细胞增殖活性;Western blot实验检测磷酸化成纤维细胞生长因子受体底物2(P-FRS2)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(P-ERK)、胆固醇7α-羟化酶(Cyp7Al)的蛋白表达水平;免疫组化法检测动物肝脏中促增殖指标Ki67和增殖细胞核抗原(PCNA)的蛋白表达水平;RT-qPCR法检测动物肝脏中肿瘤指标甲胎蛋白(AFP)、细胞周期蛋白A2(CCNA2)、表皮生长因子受体(EGFR)的相对mRNA水平;质谱法测定肝脏中胆酸(CA)、脱氧胆酸(DCA)、熊去氧胆酸(UDCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)的含量;以db/db小鼠为模型,连续给药1个月,监测药物的慢性降糖效果,糖耐量实验检测其对糖耐量的改善能力.结果:以蛋白结构为基础成功构建了 FGF19F159A,经过表达纯化得到了高纯度的目的蛋白;PLA结果显示,与FGF19WT组相比,FGF19F159A诱导受体二聚化的能力明显减弱(P＜0.01);MTT实验显示,与FGF19WT组相比,FGF19F159A的促增殖活性明显减弱(P＜0.05);Western blot实验表明,与FGF19WT组相比,FGF19F159A明显下调P-FRS2和P-ERK的蛋白表达水平(P＜0.05);免疫组化结果显示,与FGF19WT组相比,FGF19F159A组Ki67和PCNA的蛋白表达水平显著降低(P＜0.01);与FGF19WT组相比,FGF19F159A组AFP、CCNA2、EGFR的mRNA水平明显降低(P＜0.01);与FGF19WT组相比,FGF19F159A组肝脏中Cyp7Al的蛋白表达水平,胆汁酸CA、DCA、UDCA、CDCA的含量差异无统计学意义(P＞0.05);与FGF19WT组相比,FGF19F159A组的降糖能力和改善糖耐量的能力差异无统计学意义(P＞0.05).结论:基于FGFR非对称二聚化模型设计的FGF19改构体FGF19F159A能够在极大减弱细胞增殖活性的同时保留其代谢活性,有望成为治疗胆汁淤积症的候选药物.

目的 观察银杏叶提取物(GBE)对脑卒中后抑郁(PSD)模型大鼠抑郁样行为的干预作用,并研究其通过调控Toll样受体4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)通路抑制神经炎症的作用机制.方法 大鼠随机分为假手术组、脑缺血组、PSD组、帕罗西汀组、银杏叶提取物低剂量(GBE-L)组及银杏叶提取物高剂量(GBE-H)组,每组10只.除假手术组外,其余各组大鼠均进行大脑中动脉栓塞术(MCAO)制备左侧脑缺血再灌注模型.除假手术组和脑缺血组外,其余各组大鼠予慢性不可预知温和刺激(CUMS)建立PSD大鼠模型,持续刺激8周.刺激4周后,帕罗西汀组、GBE-L及GBE-H组分别给予帕罗西汀5 mg·kg-1、GBE50 mg·kg-1、GBE100 mg·kg-1治疗,假手术组、脑缺血及PSD组给予等体积0.9％NaCl,连续灌胃给药28 d.在造模第4周和第8周,分别测定大鼠体质量和糖水偏好率.用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血清白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平及大脑皮质中去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)水平;用聚合酶链反应法检测大鼠海马Tlr4、Nfkb1、核因子κB激酶亚基β抑制因子(Ikbkb)mRNA水平;用蛋白质印迹法检测大鼠海马组织NF-κB、核因子κB抑制蛋白α(IKBα)以及磷酸化核因子κB抑制蛋白α(p-IKBα)蛋白表达水平.结果 假手术组、脑缺血组、PSD组、帕罗西汀组、GBE-L及GBE-H组给药治疗后大鼠体质量分别为(427.10±6.36)、(403.10±7.37)、(310.10±9.71)、(355.00±4.03)、(347.90±9.88)和(391.90±5.07)g;给药治疗后大鼠糖水消耗率分别为(93.93±1.78)％、(91.57±1.03)％、(54.72±7.34)％、(88.35±4.36)％、(63.55±12.73)％和(81.04±4.31)％;大脑皮质 NE 含量分别为(1 951.14±52.86)、(1 827.27±23.63)、(1 662.12±35.92)、(2 033.58±72.28)、(1 887.31±33.07)和(2 175.00±42.54)pg·mL-1;大脑皮质 5-HT 含量分别为(237.07±8.86)、(226.15±10.27)、(214.51±3.46)、(297.13±5.79)、(274.14±7.63)和(285.34±8.72)ng·mL-1;大脑皮质 DA 含量分别为(1 531.11±47.26)、(1 209.89±58.09)、(1 143.15±36.31)、(1 812.67±51.28)、(1 651.56±31.82)和(1 853.33±20.42)pg·mL-1.与PSD组相比,GBE能显著增加大鼠体质量(P＜0.01),提高大鼠糖水消耗率,表现出抗抑郁样行为作用.GBE显著降低血清中 TNF-α、IL-1β水平(均P＜0.01),增加大脑皮质中NE、5-HT、DA水平(均P＜0.01);下调Tlr4、Nfkb1、Ikbkb mRNA 水平(P＜0.05,P＜0.01);减少 NF-κB 蛋白表达(P＜0.01),降低IKBα磷酸化水平(P＜0.01).结论 银杏叶提取物可减轻PSD大鼠抑郁样行为,具有抗抑郁作用,其机制与抑制TLR4/NF-κB通路减轻神经炎症有关.

目的 明确哺乳期营养过剩影响小鼠肥胖过程中,腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)/去乙酰化酶1(sirtuin1,SIRT1)-叉头框蛋白O1(forkhead box protein O1,FOXO1)信号通路蛋白翻译后修饰水平防治肥胖的新靶标及新策略.方法 C57BL/6刚出生雄性小鼠随机分为对照组(control,CON,8只/乳母)和小窝组(small litter control group,SC,5只/乳母),3周断乳后给与标准膳食喂养6周至成年,CON组和SC组小鼠分别被分为两组:CON和高脂对照组(high fat control,HFC),SC和小窝HFC(small litter HFC,SHFC)组.CON和SC组小鼠继续食用标准膳食,HFC和SHFC组小鼠高脂膳食诱导肥胖7周.分期处死小鼠取材,酶法测量血脂,Western blot法检测蛋白的表达,苏木精-伊红染色法进行病理学观察.结果 与CON或HFC相比,各阶段SC或SHFC组的体脂、体重、血清甘油三酯水平均升高(P＜0.05),高密度脂蛋白胆固醇水平降低(P＜0.05);16周末SHFC组小鼠肝细胞脂肪变性明显高于SC组.与CON或HFC、SC组比较,SC或SHFC组SIRT1、磷酸化AMPK蛋白持续降低(P＜0.05),乙酰化FOXO1蛋白持续升高(P＜0.05).结论 哺乳期营养过剩可通过AMPK/SIRT1-FOXO1信号通路的表观遗传学机制,持续降低AMPK蛋白的磷酸化,升高FOXO1蛋白的乙酰化,导致脂代谢紊乱,体脂积蓄和肥胖.

目的:探讨血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶1(SGK1)在小鼠细胞周期G1期受精卵早期发育过程中的调控作用,并阐明相关机制.方法:取若干只 4～6周龄且体质量约为 20 g的雌鼠和若干只8周龄以上且体质量约为30 g的雄鼠,雌鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG),每只10 IU,48 h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(HCG),每只10 IU,并将注射HCG的雌鼠与雄鼠 1∶1合笼过夜.取交配成功的雌鼠受精卵,注射HCG后分别于 12～21 h、21～26 h、26～28 h和28～30 h收集细胞周期G1期、S期、G2期及M期的受精卵,并于光学显微镜下观察不同细胞周期的细胞形态表现.收集小鼠超排卵后 G1 期受精卵,体外转录生成 mRNA 后,分为未注射组、Tris-EDTA缓冲液注射组(TE注射组)和SGK1-mRNA注射组.采用SGK1抗体与KSOM培养液配置1∶25、1∶50、1∶100、1∶200和0共5种不同浓度SGK1抗体组的培养液,培养小鼠G1期受精卵.Western blotting法检测各组小鼠受精卵中SGK1蛋白表达水平和各组小鼠及不同浓度SGK1抗体组HCG注射不同时间受精卵中磷酸化细胞分裂周期因子 2(Cdc2)酪氨酸 15位点(Cdc2-pTyr15)去磷酸化情况,相差显微镜观察各组小鼠和不同浓度SGK1抗体组受精卵发育情况,Western blotting法检测HCG注射不同时间小鼠受精卵中磷酸化SGK1-苏氨酸256位点(SGK1-pThr256)和Cdc2-pTyr15蛋白表达水平.结果:与未注射组和TE注射组比较,SGK1-mRNA注射组SGK1蛋白表达水平明显升高(P<0.01).HCG注射后27～28 h,SGK1-mRNA注射组小鼠受精卵中Cdc2-pTyr15磷酸化信号逐渐消失,至HCG注射29 h,Cdc2-pTyr15磷酸化信号完全消失;HCG注射后28～29 h,未注射组和TE注射组小鼠受精卵中Cdc2-pTyr15磷酸化信号逐渐消失,至HCG注射后 30 h,Cdc2-pTyr15磷酸化信号完全消失;随着SGK1抗体浓度升高,不同浓度SGK1抗体组受精卵中Cdc2-pTyr15磷酸化信号减弱和磷酸化信号消失的时间逐渐延长.HCG注射后27 h,SGK1-mRNA注射组小鼠受精卵开始卵裂;HCG注射后31 h,SGK1-mRNA注射组受精卵几乎全部分裂为G2期细胞受精卵;HCG注射后33 h,0 和 1∶200 SGK1 抗体组受精卵全部发生卵裂;随着 SGK1 抗体浓度升高,1∶25、1∶50 和1∶100 SGK1抗体组受精卵卵裂逐渐减少,在1∶25 SGK1 抗体组受精卵卵裂减少最明显.HCG注射后 31 h,与未注射组和TE注射组比较,SGK1-mRNA注射组小鼠受精卵死亡率明显降低(P<0.05),卵裂率明显升高(P<0.05).注射HCG后31和33 h,随着SGK1抗体浓度升高,与1∶200 SGK1抗体组比较,1∶100、1∶50和1∶25 SGK1抗体组受精卵死亡率逐渐升高(P<0.05),卵裂时间延长,受精卵卵裂率降低(P<0.05),并呈剂量依赖性,其中 1∶25 SGK1 抗体组受精卵卵裂率最低.HCG注射后 27 h,小鼠受精卵中SGK1-pThr256蛋白表达水平逐渐升高(P<0.05或P<0.01),并呈时间依赖性;HCG注射后28～29 h,小鼠受精卵中Cdc2-pTyr15蛋白表达水平逐渐降低(P<0.01),并呈时间依赖性,并于HCG注射后30 h完全消失.结论:过表达或抑制SGK1均会影响小鼠G1期受精卵进入M期的时间,SGK1蛋白可能是小鼠G1期受精卵早期发育的调控因子之一,其可能通过Cdc2调节G1期受精卵发育.

ent-柯巴基焦磷酸合酶(ent-copalyl diphosphate synthase,CPS)与ent-贝壳杉烯合酶(ent-kaurene synthase,KS)的连续催化是植物以香叶基香叶基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP)为底物开启赤霉素生物合成路径的关键步骤.该研究通过分析与挖掘瑞香狼毒的转录组数据,成功克隆得到赤霉素途径的 2 个关键二萜合酶基因SchCPS和SchKS.二者完整开放阅读框分别为 2595、1701 bp,编码864、566 个氨基酸残基,生物信息学分析预测其相对分子质量分别为97.9、64.6 kDa,理论等电点为 5.61、6.12,均为亲水性蛋白.序列比对及系统发育树显示,SchCPS蛋白含有CPS基因家族保守的LHS、PNV及DxDD基序,归类于TPS-c亚家族;SchKS蛋白含有KS基因家族保守的DDxxD、NSE/DTE和PIx基序,归类于TPS-e亚家族.功能验证结果表明,SchCPS可催化GGPP质子化并环化成ent-CPP,SchKS则作用于ent-CPP去磷酸化并再次环化生成贝壳杉烯.该文首次从瑞香狼毒中克隆获得SchCPS与SchKS全长基因,并完成功能验证,不仅丰富了现有的CPS和KS基因库,也为瑞香狼毒中更多活性成分基因的克隆与生物合成途径解析奠定了基础.