本实验室中保存的一株从土壤中分离得到的米尔贝链霉菌(Streptomyces milbemycinicus)27号菌株所产米尔贝霉素A3和A4的初始产量分别为61.0和23.8μg/mL.以该菌株为出发菌株,采用核糖体工程技术,结合紫外诱变技术,对米尔贝霉素产生菌米尔贝链霉菌进行诱变,并以链霉素耐受为筛选压力进行筛选.经过诱变后对单菌落进行摇瓶复筛,其中正突变株中米尔贝霉素产量最高的菌株编号是R2-6-5,其米尔贝霉素A3和A4的产量分别是105.2和38.8μg/mL,较原始菌株分别提高了72.5％和63.3％,且遗传稳定.最后,对产量变化较大的11株突变株基因组中rsmG基因和rspL基因进行突变位点分析,发现在rspL基因内均未发生突变,rsmG基因均发生突变.本研究表明,链霉素抗性降低的突变菌株确实都在相关基因内发生突变,且核糖体工程结合紫外诱变的诱变方式效果良好,能够快速有效的提高米尔贝链霉菌生物合成米尔贝霉素的能力.

目的 应用理性选育理论,结合各种诱变手段,获得米尔贝霉素A4(1),A3(2)的高产菌种.方法 以吸水链霉菌CGMCC7677为出发菌,通过紫外、甲基磺酸乙酯与常压室温等离子体等单独诱变或组合诱变,结合含甘氨酸、利福平、乙酸钠和3-溴丙酮酸的抗性平板进行筛选.结果 通过多轮的筛选,得到米尔贝霉素突变株75-22和95-23.在不改变培养基组成和培养条件的情况下,75-22在50L发酵罐中培养360h,米尔贝霉素A4(1)的生产能力提高了5倍,米尔贝霉素A4(1)的含量也从70％提高至80％以上.95-23在50L发酵罐中培养360h,米尔贝霉素A3(2)的生产能力提高了10倍,米尔贝霉素A3(2)的含量提高至70％以上.结论 主产单一组分菌种的获得,可进一步扩大米尔贝霉素的应用研究范围,也为米尔贝霉素的产业化提供了优良的菌种.

目的 对发酵生产的5-酮基米尔贝霉素的杂质谱进行了研究.方法 采用制备硅胶色谱法,以正庚烷-丙酮(95∶5,V/V)为流动相,从5-酮基米尔贝霉素A3/A4粗品中分离制备了两个工艺杂质C、D,以及两个降解杂质E、F.通过质谱、核磁共振波谱法对4个杂质进行了结构确证.结果 通过HPLC图谱比对及液质联用确定了粗品液相色谱图中两个未知杂质峰E、F分别为5-酮基米尔贝霉素A3、A4的碱降解杂质.简要分析了上述杂质间的关系,以及在米尔贝肟成品中的残留.结论 为5-酮基米尔贝霉素完整杂质谱研究奠定了基础,也为5-酮基米尔贝霉素及成品米尔贝肟质量控制策略的制定提供了参考.

本文报道了超声波辅助提取米尔贝链霉菌中米尔贝霉素A3和A4的产量的方法,采用反向高效液相表征米尔贝霉素A3和A4的产量,并通过响应面法来优化提取工艺.对提取时间(X1)、超声功率(X2)和占空比(X3)进行了三因素三水平Box-Behnken设计,以获得米尔贝霉素A3(Y1)和A4(y2)的最佳产量.研究表明,最佳超声波辅助提取条件为:溶剂为乙酸乙酯,料液比0.8,提取时间30min,超声功率110W,占空比40％和提取温度10℃.在此提取条件下米尔贝霉素A3和A4的最大产量分别为312.5和174mg/g,分别是传统提取方法产量的2.3和2.5倍.

以米尔贝霉素产生菌株M1834与M18102为出发菌株.用溶菌酶处理米尔贝吸水链霉菌获得原生质体,采用原生质体融合育种技术,通过摇瓶验证选育高产菌株.经大量筛选获得6株米尔贝霉素高产融合菌株,其中融合菌株M19046的发酵效价为6 433μg/mL,比出发菌株M1834(4 600 μg/mL)、M18102(4 432μg/mL)分别提高了 39.8％和45.1％,并且遗传性状稳定.测试了米尔贝霉素高产菌的保藏方法、培养周期、培养方法等条件对其产量的影响.表明微生物原生质体融合育种技术在理论和实际生产中都具有重要意义.

阿维菌素是阿维链霉菌发酵产生的十六元大环内酯类抗生素,主结构与米尔贝霉素相似,用于农业害虫防治和动物的杀虫杀螨,还具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、消炎和醒酒等功效.它通过抑制RNA复制酶,阻止病毒蛋白进入细胞核以及封闭剌突蛋白等方式,阻止病毒的复制感染和传播.已经产生抗药性的分枝杆菌和金黄色葡球菌也能被阿维菌素抑制.阿维菌素世界上年需求量为5000吨左右,基本由中国企业生产.本文回顾了阿维菌素在菌种技术、发酵技术、提取技术、制剂技术发展和组合生物学手段在本产业中的应用,建议通过菌种筛选技术、胞壁通透性调整、途径工程指导的基因改造、发酵过程的代谢流控制、气升式发酵罐应用及细胞融合育种来提高发酵水平,将阿维链霉菌与米贝霉素链霉菌细胞融合育种.