目的:评价犬肾细胞基质四价流感裂解疫苗(MDCK-Va)配伍不同佐剂后的免疫原性。方法:将高、中、低剂量的MDCK-Va和鸡胚基质四价流感裂解疫苗(egg-Va)原液分别肌肉免疫BALB/c小鼠2次，间隔3周，小鼠眼静脉采血，分离血清，血凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)试验检测抗体效价。不同剂量的MDCK-Va分别配伍QS21、AddVax、PolyI∶C、CpG ODN 1826以及AddVax/PolyI∶C(Add/Poly)联合佐剂，免疫小鼠，初次免疫21 d后，小鼠眼静脉采血，HI和微量中和(microneutralization，MN)试验检测抗体效价，同等剂量加强免疫21 d后，再次采血检测抗体效价。10 μg MDCK-Va配伍上述佐剂，加强免疫5 d后，取小鼠脾脏检测脾指数和脾细胞分型。结果:MDCK-Va诱导的各型别(H1N1、H3N2、B/Victoria和B/Yamagate)的血清效价均非劣效egg-Va诱导的血清效价。QS21/Va、AddVax/Va、PolyI∶C/Va、CpG ODN 1826/Va，以及Add/Poly/Va诱导的小鼠血清HI抗体效价均高于MDCK-Va，尤其是QS21/Va和Add/Poly/Va诱导的保护性效价，其差异具有统计学意义。对于H1N1疫苗，血清HI抗体和MN抗体之间的Pearson相关系数为0.737~0.910；对于H3N2亚型，HI抗体和MN抗体的Pearson相关系数为0.839~0.947。QS21/Va组具有明显的脾指数增高，但淋巴细胞占比降低。QS21/Va和Add/Poly/Va对小鼠脾脏中性粒细胞和CD4/CD8细胞的刺激明显强于其他佐剂。结论:Add/Poly/Va组对MDCK-Va具有较强的免疫增强作用，可作为MDCK-Va的候选佐剂。HI和MN试验检测的抗体具有很强的正相关性。

目的 建立流感病毒滴度蚀斑检测方法,研究其适用性,为基于Vero细胞基质的四价流感裂解疫苗原液生产过程提供质控手段.方法 通过优化覆盖物琼脂糖含量、病毒吸附时间及培养温度等参数,建立蚀斑法检测流感病毒滴度检测的方法,对其进行初步验证,并与鸡胚法进行比较.结果 通过对流感病毒培养条件的优化,确定覆盖物中最佳琼脂糖终浓度为1.0％(P=0.001,P＜O.05)、最佳吸附时间为90 min(P=0.001,P＜O.05),与对照差异具有统计学意义;不同温度(33℃、35℃和37℃)培养条件对病毒滴度的影响差异无统计学意义(P＞0.05).对病毒液重复性试验结果显示,由同一组试验人员连续测定8次,CV在3.73％～7.04％之间;同一组试验人员在不同工作日内对3批甲型(H3N2)病毒液测定,CV在3.46％～4.12％之间;不同试验人员测定结果的CV在1.77％～5.63％之间.表明蚀斑法重复性好、准确度高.蚀斑法与鸡胚法检测病毒滴度分别为7.84 lgPFU/mL和7.24 lgEID5o/mL,CV分别为2.90％(＜5％)和10.21％.蚀斑法在流感病毒2017-2018年流行株病毒滴度检测中应用,均获得稳定的检测结果.结论 建立的蚀斑法简便、稳定且灵敏度高,能够准确地检测流感病毒的滴度,可用于流感疫苗生产过程的质量控制研究.

目的 建立用于检测流感疫苗神经氨酸酶(neuraminidase,NA)活性的荧光底物法,并进行验证.方法 以唾液酸类似物4-MUNANA作为酶底物,通过测定NA催化底物分解后产物的荧光强度来评价NA活性.选取基于MDCK细胞制备的四价流感疫苗各单价原液(H1N1、H3N2、BV和BY)作为样品,优化荧光底物法的底物酶浓度(10、20、30、40、50 μmol/L)、作用时间(每 2 min 检测 1 次,至 90 min)、缓冲液 pH(4.5、5.5、6.5、7.5、8.5 和 9.5)及反应温度(4、25、37和45℃).以已知活性的重组NA蛋白作为参考品,验证方法的线性范围、准确度及精密度.用优化的方法检测流感疫苗生产过程中的样品(基于MDCK细胞制备的H1N1、H3N2、BV、BY相应的病毒收获液、纯化液和原液)及以MDCK细胞基质和鸡胚基质制备的四价流感裂解疫苗成品各1批.结果 最佳反应条件为:酶底物浓度20μmol/L,反应时间40 min,pH 7.5,反应温度37℃.重组NA蛋白参考品浓度在62.5～2 000 U/L范围内与荧光强度呈良好的线性关系,R2＞0.99;1 600、800、400 U/L 3个浓度参考品的回收率分别为92.60％～106.96％、85.54％～113.11％、87.00％～114.54％,于 2 个时间点共 12 次检测结果的 CV 分别为 6.40％、8.25％、6.92％.H1N1、H3N2、BV 和 BY 4种亚型的流感疫苗半成品在不同阶段NA活性逐渐降低;细胞基质及鸡胚基质四价流感裂解疫苗成品的NA活性分别为61 585.82和69 583.51 U/L.结论 成功建立并优化了一种NA活性的荧光底物检测方法,该方法具有良好的准确度和精密度,可应用于流感疫苗生产过程及成品中NA活性的检测.