目的 建立科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR检测方法, 并在广东口岸进行应用.方法 分析埃博拉病毒基因组的同源性, 设计3组引物和探针用于科特迪瓦型埃博拉病毒核酸检测.对不同浓度的科特迪瓦型埃博拉病毒体外转录RNA进行检测, 确定最佳的引物和探针组合、用量, 以及Mg2+用量, 建立科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR方法.对建立的方法进行灵敏度、特异性和灵敏度分析, 并用于广东口岸非洲入境发热人员血清样本的筛查.结果 经筛选, 引物Ebv-C-3F/Ebv-C-3R和探针Ebv-C-3P对102105拷贝/ml的阳性质粒的检出率为100.0％, 是最佳的引物和探针组合.优化后的实时荧光PCR体系中引物和探针终浓度分别为400 nmol/L和80 nmol/L, Mg2+终浓度为2 mmol/L.方法的灵敏度为50拷贝/ml, 重复性好、特异性强, 对扎伊尔型、苏丹型、本迪布焦型和莱斯顿型埃博拉病毒阳性对照样本、马尔堡病毒阳性对照样本和广东口岸非洲发热入境人员血清样本检测均为阴性.结论 建立的科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR检测方法灵敏度高, 特异性强, 重复性好, 对于境外输入性埃博拉病毒病病例的早期诊断和分型鉴别具有重要意义.

目的 建立苏丹型埃博拉病毒实时荧光PCR检测方法,为埃博拉病毒分型检测提供技术储备.方法 比较15株埃博拉病毒基因序列的保守性和特异性,设计3对引物和探针用于苏丹型埃博拉病毒核酸检测.使用不同浓度的苏丹型埃博拉病毒RNA对照进行检测,确定最佳的引物探针组合、引物探针用量和Mg2+用量,建立苏丹型埃博拉病毒实时荧光PCR方法.对建立的方法进行灵敏度、特异性和精密度分析,并用于广东口岸非洲入境发热人员血清样本的筛查.结果 经筛选,设计的引物、探针Ebv-S-2F/Ebv-S-2R/Ebv-S-2P对1.6×102～1.6×105拷贝/ml的阳性对照检出率为100.0％,是最佳的引物探针组合.优化后的实时荧光PCR体系引物和探针终浓度分别为400 nmol/L和80 nmol/L,Mg2+终浓度为2 mmol/L.灵敏度为80拷贝/ml,重复性好,特异性强,对扎伊尔型、科特迪瓦型、本迪布焦型和莱斯顿型埃博拉病毒阳性对照,马尔堡病毒阳性对照、登革病毒、黄热病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒等检测结果均为阴性.结论 建立的苏丹型埃博拉病毒实时荧光PCR检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好,可用于口岸输入性埃博拉出血热病例的早期检测和分型鉴别.

目的 建立扎伊尔型(EBOZ)、苏丹型(EBOS)、科特迪瓦型(EBOC)、本迪布焦型(EBOB)和莱斯顿型(EBOR)埃博拉病毒多重实时荧光PCR检测方法,一次检测可实现5种埃博拉病毒的分型.方法 比较5种15株埃博拉病毒基因组的保守性和特异性,设计5种埃博拉病毒特异性引物和探针用于核酸检测,EBOZ、EBOS、EBOC、EBOB和EBOR分别使用FAM、VIC、Texas red、FAM、VIC荧光基团标记探针.分2管对5种埃博拉病毒进行多重实时荧光PCR检测,其中管1检测EBOZ、EBOS和EBOC,管2检测EBOB和EBOR.使用不同浓度的埃博拉病毒阳性对照质粒进行检测,确定最佳的引物、探针用量和Mg2+用量,建立5种埃博拉病毒分型检测的多重实时荧光PCR方法.同时,对建立的方法进行灵敏度、特异性和灵敏度分析.结果 优化的多重实时荧光PCR方法 的引物和探针终浓度分别为160 nmol/L和80 nmol/L,Mg2+终浓度为2 mmol/L.建立的方法灵敏度为103拷贝/ml,EBOZ、EBOS、EBOC、EBOB和EBOR实时荧光PCR检测10次的CV值分别为0.16％、0.25％、0.24％、0.22％、0.28％.埃博拉病毒多重实时荧光PCR对马尔堡病毒阳性对照,登革病毒、黄热病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、裂谷热病毒等阳性毒株检测结果为阴性.结论 建立的5种埃博拉病毒多重实时荧光PCR检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好,可用于口岸输入性埃博拉出血热病例的早期检测和分型鉴别.

委内瑞拉马脑炎病毒引起的委内瑞拉马脑炎是一种自然疫原性疾病.该病毒可诱导感染的宿主产生细胞、体液和粘膜免疫应答,可通过分子生物学技术改造为理想的疫苗载体,从而表达病毒和细菌的多种蛋白.这些病原体包括Ⅰ型人类免疫缺陷病毒、流行性感冒病毒、人乳头瘤病毒16型、Norwalk样病毒、埃博拉病毒、苏丹病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒、麻疹病毒、炭疽杆菌和金黄色葡萄球菌等,本文综述委内瑞拉马脑炎病毒介导的病原体疫苗的研制现状.

埃博拉出血热是埃博拉病毒所致急性烈性传染病,该病于1976年首次发现于非洲南苏丹和刚果民主共和国,2013～2014年因埃博拉而死亡的人数已经超过了自1976年首次有记载的疫情暴发以来的死亡总数[1].埃博拉病毒分为扎伊尔型、苏丹型、塔伊森林型、雷斯顿型和本迪布焦型.感染后潜伏期一般为2～21 d,患者大多有迅速发热、肌肉疼痛、寒战和头痛等症状,之后出现咽痛、呕吐、腹泻等,约1/2的病人有出血症状,病死率较高,约在50％～90％[24].埃博拉病毒的自然宿主尚不明确,大多数认为是非洲果蝠,也可能是猩猩、猴子等[5].笔者从军事医学地理学角度,探讨其在埃博拉疾病发生、防治中发挥的重要作用,为军队卫勤保障工作提供科学依据.

目的 原核表达苏丹型埃博拉病毒(Sudan virus,SUDV)糖蛋白(GP),并作为包被抗原建立抗体间接ELISA检测方法. 方法 PCR扩增SUDV GP基因片段,克隆至pET30a(+)表达载体,IPTG诱导表达SUDV GP,经His-Ni柱纯化,SDS-PADE和Western blot鉴定正确的SUDV GP作为包被抗原建立SUDV抗体间接ELISA方法,并对实验条件进行优化. 结果 SUDV GP在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,建立的抗体间接ELISA检测方法最佳SUDV GP包被量为2μg/孔,待检血清最佳稀释度为1∶320,最佳作用时间1.5h,HRP标记羊抗鼠IgG最佳稀释度1∶10 000,TMB最佳显色时间为7 min.该方法的特异性强,样品检测结果与已知血清的符合率为100％,检测SUDV阳性血清的敏感度为1∶40 960,SUDV GP批间及批内的实验结果变异系数(CV)均小于10％. 结论 成功表达SUDV GP并建立SUDV抗体间接ELISA检测方法,为疫苗免疫效果的评价、疫病的监测及SUDV抗体检测试剂盒的研发奠定了基础.