目的 建立扎伊尔型埃博拉病毒实时荧光定量PCR快速检测技术.方法 人工合成扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白GP基因上1 969～2 113 bp的保守特异片段,克隆到pUC57重组质粒中,构建阳性模板;以103～ 109拷贝数的重组质粒样品共7组作为标准品,制作标准曲线;设计上游引物5'-GAACCACATGATTGGACCAAGA-3'、下游引物5'-TAACTCCAATACCTGCCGGTATC-3'及TaqMan探针FAM 5'-TTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGG-3'BHQ1,采用普通PCR和实时荧光定量PCR,检测其特异性和灵敏度.结果 克隆出含GP 1 969～2 113 bp片段的阳性重组质粒pUC57-GP,其浓度为97.75 ng/μl;以pUC57-GP为标准品,制备标准曲线,拷贝数为103～109 copies/μL有较好线性关系,相关系数R2=0.999;能特异性检测扎伊尔型埃博拉病毒,而与Ⅰ型登革病毒、寨卡病毒无交叉反应,其检测最低拷贝数达3.10×101copies/μl.结论 建立了扎伊尔型埃博拉病毒荧光定量PCR快速检测技术,具有快速、灵敏、特异、定量检测等特点,可为埃博拉疫情的综合防控提供技术支撑.

本刊对2018年5—6月全球重点传染病疫情(截至6月26 日)汇总如下.1 刚果(金)再次暴发埃博拉疫情2018年5月初,刚果(金)再次暴发埃博拉疫情,截至6月24日,刚果(金)累计报告55例埃博拉病毒病病例,其中确诊病例38例,临床诊断病例14例,疑似病例3例.目前已死亡28例.病毒类型为扎伊尔型.这是自埃博拉病毒1976年被命名以来,刚果(金)第9次暴发埃博拉疫情.

目的 采用扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白(EBOV NP)的合成多肽为免疫原制备鼠源单克隆抗体,并用4种埃博拉流行株核蛋白基因的真核表达蛋白对制备的单克隆抗体进行特异性分析.方法 用人工合成的扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白多肽免疫动物,进行细胞融合后筛选阳性杂交瘤细胞.构建埃博拉病毒4种亚型的真核表达载体转染HEK293T细胞以表达目的蛋白,再以真核表达蛋白为抗原,用免疫印迹方法分析扎伊尔型埃博拉病毒单克隆抗体的特异性.结果 完成了抗扎伊尔型单克隆抗体的制备,共得到能分泌抗扎伊尔型埃博拉病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞12株,小鼠腹水抗体效价介于1:104～1:105,其中3株杂交瘤细胞株分泌的抗扎伊尔型埃博拉病毒单克隆抗体与其他3种亚型无交叉反应,抗体效价高、特异性好.结论 成功制备抗扎伊尔型埃博拉病毒单克隆抗体,为建立快速检测埃博拉病毒的方法奠定基础.

目的 研制可用于扎伊尔型埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)核酸检测试剂质量评价的国家参考品,并建立相关试剂的质量标准.方法 通过分子生物学方法制备含有5种EBOV核蛋白和糖蛋白基因目的片段的RNA噬菌体颗粒、质粒菌液和RNA体外转录产物作为参考品候选样本,使用6种出血热病毒、虫媒病毒培养液和含拉沙热病毒核蛋白和糖蛋白基因的质粒菌液作为阴性参考品候选样本.分别应用培养法和荧光定量PCR确定病毒滴度和核酸浓度,应用RT-PCR、荧光定量PCR对候选样本进行序列鉴定和交叉污染检查.采用RNaseA和DNase Ⅰ抵抗试验确认RNA噬菌体颗粒的包装完整性.对于序列正确、无污染的候选样本进行稀释分装,发放5家EBOV核酸检测试剂生产企业进行适用性验证,根据结果确定参考品盘的阳性、阴性、最低检测限和精密度组成及试剂质量标准.结果 RNA噬菌体颗粒包装的RNA序列与预期完全一致,颗粒包装完整且内含DNA残留污染低于RNA含量的1/10 000,可以用于制备参考品.经适用性验证,确定国家核酸参考品盘包括4份阳性、16份阴性参考品(其中8份型别特异性参考品)、14份最低检测限和2份(4支)精密度参考品,均为冰冻样本.适用性验证结果显示,各申报试剂均能检出扎伊尔型EBOV核酸,但最低检测限存在一定差异.结论 建立的扎伊尔型EBOV核酸检测试剂国家参考品适用于现有的5家已申报应急审批的扎伊尔型EBOV核酸检测试剂,可用于相关试剂的质量控制,且对于该类试剂的研发具有重要指导意义.

目的 建立科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR检测方法, 并在广东口岸进行应用.方法 分析埃博拉病毒基因组的同源性, 设计3组引物和探针用于科特迪瓦型埃博拉病毒核酸检测.对不同浓度的科特迪瓦型埃博拉病毒体外转录RNA进行检测, 确定最佳的引物和探针组合、用量, 以及Mg2+用量, 建立科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR方法.对建立的方法进行灵敏度、特异性和灵敏度分析, 并用于广东口岸非洲入境发热人员血清样本的筛查.结果 经筛选, 引物Ebv-C-3F/Ebv-C-3R和探针Ebv-C-3P对102105拷贝/ml的阳性质粒的检出率为100.0％, 是最佳的引物和探针组合.优化后的实时荧光PCR体系中引物和探针终浓度分别为400 nmol/L和80 nmol/L, Mg2+终浓度为2 mmol/L.方法的灵敏度为50拷贝/ml, 重复性好、特异性强, 对扎伊尔型、苏丹型、本迪布焦型和莱斯顿型埃博拉病毒阳性对照样本、马尔堡病毒阳性对照样本和广东口岸非洲发热入境人员血清样本检测均为阴性.结论 建立的科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR检测方法灵敏度高, 特异性强, 重复性好, 对于境外输入性埃博拉病毒病病例的早期诊断和分型鉴别具有重要意义.

目的 建立苏丹型埃博拉病毒实时荧光PCR检测方法,为埃博拉病毒分型检测提供技术储备.方法 比较15株埃博拉病毒基因序列的保守性和特异性,设计3对引物和探针用于苏丹型埃博拉病毒核酸检测.使用不同浓度的苏丹型埃博拉病毒RNA对照进行检测,确定最佳的引物探针组合、引物探针用量和Mg2+用量,建立苏丹型埃博拉病毒实时荧光PCR方法.对建立的方法进行灵敏度、特异性和精密度分析,并用于广东口岸非洲入境发热人员血清样本的筛查.结果 经筛选,设计的引物、探针Ebv-S-2F/Ebv-S-2R/Ebv-S-2P对1.6×102～1.6×105拷贝/ml的阳性对照检出率为100.0％,是最佳的引物探针组合.优化后的实时荧光PCR体系引物和探针终浓度分别为400 nmol/L和80 nmol/L,Mg2+终浓度为2 mmol/L.灵敏度为80拷贝/ml,重复性好,特异性强,对扎伊尔型、科特迪瓦型、本迪布焦型和莱斯顿型埃博拉病毒阳性对照,马尔堡病毒阳性对照、登革病毒、黄热病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒等检测结果均为阴性.结论 建立的苏丹型埃博拉病毒实时荧光PCR检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好,可用于口岸输入性埃博拉出血热病例的早期检测和分型鉴别.

目的 建立扎伊尔型(EBOZ)、苏丹型(EBOS)、科特迪瓦型(EBOC)、本迪布焦型(EBOB)和莱斯顿型(EBOR)埃博拉病毒多重实时荧光PCR检测方法,一次检测可实现5种埃博拉病毒的分型.方法 比较5种15株埃博拉病毒基因组的保守性和特异性,设计5种埃博拉病毒特异性引物和探针用于核酸检测,EBOZ、EBOS、EBOC、EBOB和EBOR分别使用FAM、VIC、Texas red、FAM、VIC荧光基团标记探针.分2管对5种埃博拉病毒进行多重实时荧光PCR检测,其中管1检测EBOZ、EBOS和EBOC,管2检测EBOB和EBOR.使用不同浓度的埃博拉病毒阳性对照质粒进行检测,确定最佳的引物、探针用量和Mg2+用量,建立5种埃博拉病毒分型检测的多重实时荧光PCR方法.同时,对建立的方法进行灵敏度、特异性和灵敏度分析.结果 优化的多重实时荧光PCR方法 的引物和探针终浓度分别为160 nmol/L和80 nmol/L,Mg2+终浓度为2 mmol/L.建立的方法灵敏度为103拷贝/ml,EBOZ、EBOS、EBOC、EBOB和EBOR实时荧光PCR检测10次的CV值分别为0.16％、0.25％、0.24％、0.22％、0.28％.埃博拉病毒多重实时荧光PCR对马尔堡病毒阳性对照,登革病毒、黄热病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、裂谷热病毒等阳性毒株检测结果为阴性.结论 建立的5种埃博拉病毒多重实时荧光PCR检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好,可用于口岸输入性埃博拉出血热病例的早期检测和分型鉴别.

埃博拉出血热是埃博拉病毒所致急性烈性传染病,该病于1976年首次发现于非洲南苏丹和刚果民主共和国,2013～2014年因埃博拉而死亡的人数已经超过了自1976年首次有记载的疫情暴发以来的死亡总数[1].埃博拉病毒分为扎伊尔型、苏丹型、塔伊森林型、雷斯顿型和本迪布焦型.感染后潜伏期一般为2～21 d,患者大多有迅速发热、肌肉疼痛、寒战和头痛等症状,之后出现咽痛、呕吐、腹泻等,约1/2的病人有出血症状,病死率较高,约在50％～90％[24].埃博拉病毒的自然宿主尚不明确,大多数认为是非洲果蝠,也可能是猩猩、猴子等[5].笔者从军事医学地理学角度,探讨其在埃博拉疾病发生、防治中发挥的重要作用,为军队卫勤保障工作提供科学依据.

1背 景2019年12月19日,美国食品药品监督管理局批准了默克公司生产的埃博拉疫苗(ERVEBO)用于预防≥18岁成人感染埃博拉病毒(扎伊尔型埃博拉病毒)引起的埃博拉病毒病.2020年2月,美国免疫实践咨询委员会建议对美国≥18岁、因应对埃博拉病毒病暴发而处于潜在职业暴露埃博拉病毒风险最高的成年人开展埃博拉疫苗暴露前接种,包括美国联邦政府指定的埃博拉治疗中心的医护人员,以及美国4级生物安全实验室的实验人员及其他工作人员.