目的:探索依托泊苷(VP-16)对人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus-1, HIV-1)潜伏感染的激活作用并研究其潜在的分子机制。方法:将HIV-1潜伏感染细胞系J-Lat分为二甲基亚砜(DMSO)处理组、VP-16处理组及伏立诺他(SAHA)处理组，利用流式细胞技术检测细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)阳性比例，评估高浓度VP-16对HIV-1潜伏感染的激活效率；通过流式细胞技术检测VP-16在不同作用浓度及不同作用时间下对HIV-1潜伏感染的激活效果；通过流式细胞技术检测在VP-16作用下J-Lat细胞中CD25、CD69及白介素-6(interleukin-6, IL-6)的表达情况；运用双荧光素酶报告系统检测VP-16对HIV-1长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)转录水平的影响；使用蛋白质印迹技术(western blot, WB)检测VP-16作用下蛋白沉默信息调节因子1(silent information regulator 1, SIRT1)及核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)乙酰化p65的表达水平；利用慢病毒介导的靶向SIRT1短发夹RNA(SIRT1 short-hairpin RNA, SIRT1-shRNA)敲低J-Lat细胞的SIRT1表达并检测相应的激活效果。结果:流式细胞技术分析结果显示，VP-16能够特异性地激活HIV-1潜伏感染细胞系J-Lat，其激活效果存在浓度依赖和时间依赖；VP-16激活HIV-1潜伏感染的同时会一定程度上调J-Lat细胞的CD25及CD69，但IL-6的表达水平无明显变化；双荧光素酶报告实验提示VP-16通过NF-κB信号通路正向调控HIV-1 LTR的转录水平；WB结果表明VP-16能够抑制SIRT1的蛋白表达并促进NF-κB p65的乙酰化水平；慢病毒SIRT1-shRNA成功敲低J-Lat细胞中SIRT1的mRNA和蛋白表达，能够有效激活HIV-1潜伏感染。结论:VP-16通过抑制SIRT1表达从而上调NF-κB p65的乙酰化水平，继而促进HIV-1 LTR的转录并最终激活HIV-1的潜伏感染。

目的:观察敲低热休克蛋白B8 （HspB8）对鼠视神经钳夹（ONC）后视网膜神经节细胞（RGC）及视网膜功能的影响。方法:构建敲低HspB8的重组腺相关病毒（AAV) 2-小发夹HspB8 （shHspB8）-绿色荧光蛋白（GFP）。雄性C57BL/6J小鼠66只随机分为正常对照组、ONC组、AAV2-shHspB8组、ONC+AAV2-shHspB8组、ONC+AAV2组，分别为10、20、16、10、10只，双眼均作为实验眼。建模后3、7 d，蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测小鼠视网膜HspB8蛋白相对表达变化；GFP免疫荧光染色确定AAV2-shHspB8-GFP转染情况。建模后5 d，视动反应（OMR）、暗适应全视野闪光视网膜电图（ff-ERG）检测各组小鼠视敏度、振荡电位（OPs ）、明视负向反应（PhNR）振幅和潜伏期；视网膜铺片计数各组小鼠RGC。采用Mann-Whitney U检验、独立样本 t检验、Welch法校正 t检验、单因素方差分析、Bonferroni t检验对数据进行统计分析。 结果:与正常对照组比较，ONC3组小鼠视网膜中HspB8蛋白相对表达量明显增加，差异有统计学意义（ F=43.63， P<0.01 ）。与正常对照组比较，ONC5组小鼠视敏度明显降低，差异有统计学意义（ P<0.01）；a波、b波、OPs、PhNR振幅下降，b波潜伏期延长，差异均有统计学意义（ P<0.05）；ONC3组、ONC5组、ONC7组小鼠RGC存活率呈时间依赖性降低，差异有统计学意义（ F=384.90， P<0.01 ）。病毒转染后4周，转染率达峰值。与正常对照组相比，AAV2-shHspB8组视敏度，a波和b波、OPs、PhNR振幅、RGC计数差异均无统计学意义（ P>0.05）；ONC5+AAV2-shHspB8组RGC计数较ONC5组明显升高，差异有统计学意义（ F=10.62， P<0.01 ）。 结论:ONC诱导HspB8在视网膜中表达，导致RGC死亡并损害小鼠视功能；下调HspB8对ONC所致的RGC死亡具有保护作用。

目的:探讨血小板源性生长因子受体α（platelet derived growth factor receptor alpha，PDGFRα）对小鼠锌指蛋白阳性间充质干细胞（glioma-associated oncogene homolog 1-positive mesenchymal stem cells，Gli1 +-MSC）双向分化的调控作用。 方法:繁育双报告转基因小鼠ROSA mT/mG/Gli1-Cre ERt2/PDGFRα fl（实验组）和ROSA mT/mG/Gli1-Cre ERt2（对照组），选取两组4周龄小鼠各20只，从小鼠主动脉外膜中分离间充质干细胞，使用他莫昔芬诱导，通过绿色荧光蛋白标记和流式细胞仪分选，筛选两组Gli1 +-MSC，实验组Gli1 +-MSC中条件性敲除PDGFRα，对照组Gli1 +-MSC正常表达PDGFRα。对两组Gli1 +-MSC分别进行成脂肪诱导和成纤维诱导，蛋白质印迹法检测两组PDGFRα、脂肪细胞标志物［脂滴包被蛋白和CCAAT/增强子结合蛋白（CCAAT/enhancer binding protein alpha，C/EBPα）］和成纤维细胞标志物［α-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）、成纤维细胞特异蛋白1（fibroblast-specific protein 1，FSP-1）］的蛋白表达，并进行半定量分析。油红O染色观察两组Gli1 +-MSC双向诱导后的细胞脂肪分化程度，并进行半定量分析。 结果:他莫昔芬诱导后，可通过绿色荧光蛋白的表达标记准确地从流式细胞仪中分离出Gli1 +-MSC。成脂肪诱导后，实验组PDGFRα蛋白表达（0.017±0.002）显著小于对照组（0.184±0.012）（ t=25.48， P=0.002），脂滴包被蛋白（3.138±0.414）和C/EBPα（3.565±0.289）蛋白表达均显著大于对照组（分别为2.312±0.218、2.179±0.103）（ t=6.21， P=0.025； t=6.69， P=0.022），即PDGFRα的敲除增强了Gli1 +-MSC的成脂肪分化能力。成纤维诱导后，实验组PDGFRα、α-SMA和FSP-1的蛋白表达（分别为0.030±0.001、0.932±0.177和0.276±0.020）均显著小于对照组（分别为0.439±0.006、1.352±0.170和0.835±0.097）（ t=149.40， P<0.001； t=66.38， P<0.001； t=11.41， P=0.008），即PDGFRα的敲除显著抑制Gli1 +-MSC向纤维细胞分化。双向诱导后，对照组可见脂肪细胞形成明显减少，实验组脂肪细胞形成较多；定量分析显示，双向诱导后实验组油红O染色量（0.461±0.042）显著多于对照组（0.017±0.007）（ t=23.20， P<0.001）。 结论:PDGFRα在调控血管外膜Gli1 +-MSC的双向分化中发挥重要作用。

目的:对丝氨酸水解酶家族1（FSH1）蛋白在犬小孢子菌中进行亚细胞定位分析。方法:以前期构建的犬小孢子菌FSH1质粒及载体pCAMBIA-LRP-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为模板，PCR扩增FSH1基因及EGFP基因；同时利用SnaBI/KpnI对pCAMBIA-LRP-EGFP质粒双酶切获得载体DNA，将扩增的EGFP基因克隆至酶切好的载体DNA中获得EGFP表达载体；将扩增的FSH1基因及EGFP基因克隆至酶切好的载体DNA中获得融合载体Ptrcp-FSH1-EGFP-Ttrcp。通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法，用重组质粒转化犬小孢子菌，使融合基因FSH1-EGFP在真菌通用启动子（Ptrpc）和终止子（Ttrpc）调控下在犬小孢子菌中整合型表达，利用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞定位。结果:成功构建根癌农杆菌转化系统及犬小孢子菌EGFP表达载体；融合基因FSH1-EGFP在犬小孢子菌中获得整合型表达。激光共聚焦显微镜显示FSH1-EGFP融合蛋白的荧光信号呈颗粒状或团块状集中于犬小孢子菌的细胞质及细胞核中。结论:FSH1-EGFP融合蛋白成功定位于犬小孢子菌的细胞质及细胞核中，为进一步明确犬小孢子菌FSH1基因的功能及致病机制奠定了基础。

聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)是应用最广泛的合成聚酯之一.由于PET不易降解,在环境中积累,对陆地、水生生态系统以及人类健康构成严重威胁.基于生物酶催化的生物降解策略为PET回收利用提供了一种绿色途径,在过去 20 年间,已发现了多种PET水解酶,并通过蛋白质工程等手段来改善这些酶的降解性能,但是目前仍未找到适合大规模工业应用的PET水解酶.利用传统的检测方法筛选PET水解酶是一个缓慢而复杂的过程.为了促进PET酶法回收的工业化应用,需要研发高效的检测方法.近年来,研究人员开发了多种表征PET水解酶的分析方法.本文总结了可用于筛选PET水解酶的检测方法,如高效液相色谱法、紫外吸光度法和荧光激活液滴分选法等,并对其在筛选PET水解酶的应用方面进行了展望.

目的·研究磷酸核糖焦磷酸合成酶1(phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1,PRPS1)I72位点突变是否能使急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)细胞对巯嘌呤类化学治疗(化疗)药物 6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)、6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine,6-TG)产生耐药性,并解释其作用机制.方法·将临床上已发现的PRPS1基因的各突变(I72F、R177S、V316L)和2个ALL细胞系(KOPN72bi和RS4;11)中存在的PRPS1基因突变(V208A、V289A)分别插入融合了绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的载体pGV303中,用已证明的对巯嘌呤类化疗药耐药的PRPS1 A190T突变为阳性对照,对该类药不耐药的空载体pGV303(Vector)、PRPS1野生型(wild type,WT)及PRPS1 I72V突变为阴性对照.将上述构建好的载体瞬时转染入HEK-293T细胞(简称293T细胞)中,并采用蛋白质印迹法(Western blotting)检测PRPS1各突变体在293T细胞中的蛋白表达情况.采用药物敏感性实验检测并计算6-MP或6-TG对上述瞬转PRPS1各突变体的293T细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50).随后,除PRPS1 I72F和I72V之外,将第72位异亮氨酸(isoleucine,I)变成其他氨基酸的多个突变即I72M、I72L、I72N、I72S、I72T分别插入载体pGV303中,瞬时转染入293T细胞后采用Western blotting、药物敏感性实验检测各突变体在293T细胞中的蛋白表达情况以及6-MP或6-TG的IC50.采用慢病毒感染法将PRPS1 WT、I72F、I72V、A190T及载体pGV303感染REH细胞系,通过流式细胞术分选GFP阳性细胞以获得PRPS1各突变体稳定表达的细胞,并采用Western blotting及药物敏感性实验检测各突变体在REH细胞中的蛋白表达情况以及6-MP或6-TG的IC50,用以验证293T细胞获得的药物敏感性实验结果.采用Annexin Ⅴ/DAPI双染法评估各REH细胞系的凋亡情况,并通过Western blotting检测各REH细胞系的DNA损伤相关蛋白[S139位点磷酸化的组蛋白H2AX(phosphorylated H2AX-S139,γ-H2AX)、磷酸化的细胞周期检验点激酶 2(phosphorylated check point kinase 2,pCHK2)]和细胞凋亡相关蛋白聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶剪切体[cleaved poly(ADP-ribose)polymerase,cleaved PARP]的表达水平.使用PDB数据库(Protein Data Bank)中编号为2HCR(PDB code 2HCR)的PRPS1晶体结构图,通过三维成像及PyMOL软件预测并绘制I72位点、I72V和I72F的氨基酸残基及空间构象图.结果·Western blotting结果显示,瞬时转染的外源性PRPS1各突变蛋白在293T细胞中成功表达;药物敏感性实验结果显示,表达PRPS1 I72F、R177S、V316L、V208A与阳性对照A190T的293T细胞对6-MP或6-TG的IC50 均远高于表达V289A及阴性对照Vector、PRPS1 WT、PRPS1 I72V的细胞(均P=0.000).将第72位异亮氨酸变成其他氨基酸后,Western blotting结果显示瞬时转染的外源性PRPS1 I72位点的各突变蛋白在293T细胞中成功表达;药物敏感性实验结果显示,表达PRPS1 I72M、I72F、I72L、I72N、I72S、I72T与A190T的293T细胞对6-MP或6-TG的IC50均远高于表达Vector、PRPS1 WT、PRPS1 I72V的细胞(均P=0.000).慢病毒感染REH细胞后,Western blotting结果显示在已构建的稳定细胞系中PRPS1 WT、A190T、I72F、I72V的蛋白高表达且表达量相似;药物敏感性实验结果显示,表达PRPS1 I72F、A190T的REH细胞对6-MP或6-TG的IC50均远高于表达Vector、PRPS1 WT、PRPS1 I72V的细胞(均P=0.000),与293T细胞中瞬时转染得到的药物敏感性结果一致.Annexin Ⅴ/DAPI双染法、DNA损伤和凋亡相关蛋白的Western blotting检测的结果均显示,经6-MP处理后,表达PRPS1 A190T、I72F的REH细胞系的DNA损伤和凋亡率明显低于表达Vector、PRPS1 WT、PRPS1 I72V的细胞(均P=0.000).蛋白结构分析结果显示,PRPS1 I72F会使PRPS1的空间构象发生改变.结论·PRPS1 I72F、R177S、V316L、V208A、I72M、I72L、I72N、I72S、I72T突变可使细胞获得对巯嘌呤类化疗药的耐药性,PRPS1 V289A、I72V突变不影响细胞对巯嘌呤类化疗药的敏感性.293T中的药物敏感性实验结果和REH中的药物敏感性实验结果一致,证明293T细胞可以作为检测PRPS1突变对巯嘌呤类化疗药物耐药性的快速研究模型.PRPS1 I72位点突变对巯嘌呤类化疗药耐药性的影响可能与PRPS1结构发生改变有关.

目的 构建pEGFP-C1-CXCL1真核表达载体,研究过表达CXCL1对内质网应激(ERS)下肝癌细胞增殖作用.方法 以HepG2细胞的cDNA文库为模板,通过PCR扩增CXCL1编码序列,并将其插入pEGFP-C1空载体,构建pEGFP-C1-CXCL1真核表达载体,随后将其瞬时转染到293 T细胞中,通过荧光显微镜和蛋白质免疫印迹法检测CXCL1在真核细胞中的表达情况,将pEGFP-C1-CXCL1转染至HepG2细胞中,CCK8检测CXCL1对TM诱导下的ERS肿瘤增殖的抑制作用.结果 菌液PCR和测序结果均证实得到pEGFP-C1-CXCL1真核表达载体,其转染293T细胞后,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,免疫印迹表明CXCL1在293T细胞中表达,CCK8实验表明,ERS条件下肿瘤的增殖受到抑制,而过表达的CXCL1可降低ERS下的HepG2细胞的增殖抑制.结论 成功构建了真核表达质粒pEGFP-C1-CXCL1,并在人胚肾293T细胞中瞬时表达成功,过表达的CXCL1可有效降低由ERS造成的肝癌细胞的增殖抑制.

目的 观察丹参酮ⅡA对严重脓毒症大鼠肠黏膜上皮细胞紧密连接蛋白的影响.方法 将75只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组(Sham组)、模型组以及丹参酮ⅡA注射液高(20 mg/kg)、中(10 mg/kg)、低(5 mg/kg)剂量组,每组15只.采用盲肠结扎穿孔术(CLP)制备脓毒症大鼠模型,Sham组仅行开关腹手术而不进行CLP.丹参酮ⅡA注射液组于制模后10 min和6 h腹腔注射不同剂量丹参酮ⅡA;Sham组、模型组于相同时间腹腔注射等体积生理盐水.全部大鼠于术后尾静脉注射生理盐水3 L/kg进行液体复苏.术后12 h处死大鼠,取腹腔淋巴结、肝脏、脾脏、肾脏组织,进行细菌培养并计算细菌移位率;光镜下观察回肠黏膜组织病理学改变并行Chiu评分;采用原位末端缺刻标记试验(TUNEL)检测回肠黏膜上皮细胞凋亡情况,并计算细胞凋亡指数(AI);采用荧光免疫法和蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测回肠组织紧密连接蛋白表面黏附分子(JAM)、闭合蛋白-1(Claudin-1)、闭锁小带蛋白1(ZO-1)、Occludin和炎症蛋白c-Fos、类胰蛋白酶(Tryptase)的含量和蛋白表达水平.结果 ① 腹腔淋巴结、肝脏、脾脏、肾脏组织细菌培养以肠系膜淋巴结阳性率最高,其次为肝脏和脾脏;主要为大肠杆菌、奇异变形杆菌等.模型组细菌培养阳性率最高为38.8%,其次为丹参酮ⅡA注射液低剂量组(35.0%),以丹参酮ⅡA注射液高剂量组最低为16.6%,各组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05).② 病理学观察显示,模型组大鼠回肠黏膜病理改变明显,Chiu评分(分:4.17±0.98比0)和AI(11.70±2.87比2.17±0.80)均较Sham组显著增高(均P<0.05);随丹参酮ⅡA注射液剂量增加,大鼠回肠黏膜病理改变改善程度逐渐增加,Chiu评分和AI均逐渐降低,以丹参酮ⅡA注射液高剂量组的降低程度较模型组更显著〔Chiu评分(分):1.12±0.79比4.17±0.98,AI:3.65±1.98比11.70±2.87,均P<0.05〕.③ 免疫荧光染色显示:蛋白JAM、ZO-1、c-Fos阳性显色均为绿色,Claudin-1、Occludin、Tryptase阳性显色均为红色,均定位在胞质,JAM、Claudin-1、ZO-1、Occludin表达由强到弱依次为Sham组和丹参酮ⅡA高、中、低剂量组以及模型组,c-Fos、Tryptase由强到弱依次为模型组和丹参酮ⅡA低、中、高剂量组以及Sham组.④ Western Blot显示:模型组回肠组织JAM、Claudin-1、ZO-1、Occludin蛋白表达均较Sham组明显降低,而c-Fos、Tryptase蛋白表达均较Sham组明显升高,随丹参酮ⅡA注射液剂量的增加,JAM、Claudin-1、ZO-1、Occludin表达逐渐升高,c-Fos、Tryptase蛋白表达逐渐降低,以丹参酮ⅡA注射液高剂量组变化较低、中剂量更显著〔JAM(灰度值):25.39±1.82比12.41±1.34、19.45±1.66,Claudin-1(灰度值):28.44±1.56比17.26±1.46、21.23±1.34,ZO-1(灰度值):28.84±1.59比16.45±1.21、24.22±1.46,Occludin(灰度值):25.49±1.63比13.34±1.45、19.45±1.37,c-Fos(灰度值):15.76±1.36比27.84±1.36、21.22±1.73,Tryptase (灰度值):14.44±1.41比28.14±1.38、22.32±1.57〕,各剂量组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05).结论 丹参酮ⅡA注射液可能通过改善脓毒症模型大鼠肠黏膜上皮紧密连接蛋白而维护肠壁结构、减少细菌移位,且这一作用与丹参酮ⅡA的剂量呈正相关.

目的 探索一种高通量定量检测细胞自噬小体数量的方法.方法 将绿色荧光蛋白-轻链蛋白3(GFP-LC3)转基因小鼠的角质形成细胞分为对照组(不接受照射或饥饿处理)、饥饿组(给予饥饿处理)、20 J/cm2长波紫外线(UVA)照射组和40 J/cm2 UVA照射组.处理后6h,将细胞固定后在共聚焦显微镜下采集图片.用ImageJ软件编辑宏指令对细胞内GFP-LC3绿色荧光点及细胞进行自动计数,并比较不同组间自噬水平.结果 利用ImageJ软件编辑的宏指令可以成功识别并计数荧光图片中的自噬小体.在测试计算机上分析一张420万像素的图片仅需不到0.6 s.饥饿组、20 J/cm2UVA照射组和40 J/cm2 UVA照射组平均自噬小体数量高于对照组,未加胃抑素A时各组间比较,F=5.01,P＜ 0.05;加入胃抑素A时各组间比较,F=20.05,P＜0.05.该方法可以成功区分饥饿组、UVA照射组和对照组的自噬水平差异.结论 成功为自噬研究提供了一种新的高通量定量检测方法,该方法能够快速准确地检测细胞自噬荧光点.

目的:探究一种小分子量类弹性蛋白标签(elastin-like protein tag,ELP tag)——ELP30-tag在原核表达系统中的蛋白纯化能力.方法:人工合成ELP30-tag基因并将其构建于pET-28a(+)载体,结合2种内含肽(intein1和intein2)基因和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)基因,构建4个含有不同元件序列的原核表达载体:pET-ELP30、pET-ELP30-eGFP、pET-ELP30-intein1-eGFP和pET-eGFP-intein2-ELP30;将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导重组蛋白表达,并通过可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)纯化重组蛋白ELP30、ELP30-eGFP、ELP30-intein1-eGFP和eGFP-intein2-ELP30,随后通过调节溶液pH值或添加二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol,DTT)分别诱导intein1和intein2断裂,最后再经ITC分离获得纯eGFP.结果:利用设计的ELP30-tag成功纯化获得了重组蛋白ELP30、ELP30-eGFP和eGFP-intein2-ELP30;重组蛋白ELP30-intein1-eGFP和eGFP-intein2-ELP30中的内含肽可经诱导发生断裂而释放eGFP,但未能分离获得纯eGFP.由此为小分子量ELP-tag的运用和优化设计奠定了一定基础.