多硫化氢(hydrogen polysulfides,H2Sn,n≥2)作为硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)所衍生的活性硫物质,在生理调节及信号转导过程中扮演着不可或缺的角色.H2Sn与H2S互为氧化还原对,一般经氧化或酶促作用从H2S转化生成,通过调节蛋白质相互作用及改变酶活力等方式发挥其生理作用.随着研究的深入,发现一些原本被认为是H2S发挥的生理学功能可能是由H2Sn所发挥的,并且H2Sn具有更高的蛋白质巯基化效率.因此,实时检测生物体内的H2Sn对于研究其生理活性及与H2S之间的联系具有十分重要的意义.传统的质谱光谱等检测方法需要破碎组织细胞,不适用于生物体内的实时检测.而荧光探针因其具有高灵敏度及特异性,同时生物毒性低常被选作H2Sn原位实时检测工具.本文概述了H2Sn的生理调节活性,着重基于响应机制的反应类型的介绍H2Sn检测荧光探针的设计策略、荧光性能、检测特点及生物成像应用等方面,并对这一领域所面临的挑战与发展进行了展望.

目的·研究磷酸核糖焦磷酸合成酶1(phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1,PRPS1)I72位点突变是否能使急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)细胞对巯嘌呤类化学治疗(化疗)药物 6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)、6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine,6-TG)产生耐药性,并解释其作用机制.方法·将临床上已发现的PRPS1基因的各突变(I72F、R177S、V316L)和2个ALL细胞系(KOPN72bi和RS4;11)中存在的PRPS1基因突变(V208A、V289A)分别插入融合了绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的载体pGV303中,用已证明的对巯嘌呤类化疗药耐药的PRPS1 A190T突变为阳性对照,对该类药不耐药的空载体pGV303(Vector)、PRPS1野生型(wild type,WT)及PRPS1 I72V突变为阴性对照.将上述构建好的载体瞬时转染入HEK-293T细胞(简称293T细胞)中,并采用蛋白质印迹法(Western blotting)检测PRPS1各突变体在293T细胞中的蛋白表达情况.采用药物敏感性实验检测并计算6-MP或6-TG对上述瞬转PRPS1各突变体的293T细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50).随后,除PRPS1 I72F和I72V之外,将第72位异亮氨酸(isoleucine,I)变成其他氨基酸的多个突变即I72M、I72L、I72N、I72S、I72T分别插入载体pGV303中,瞬时转染入293T细胞后采用Western blotting、药物敏感性实验检测各突变体在293T细胞中的蛋白表达情况以及6-MP或6-TG的IC50.采用慢病毒感染法将PRPS1 WT、I72F、I72V、A190T及载体pGV303感染REH细胞系,通过流式细胞术分选GFP阳性细胞以获得PRPS1各突变体稳定表达的细胞,并采用Western blotting及药物敏感性实验检测各突变体在REH细胞中的蛋白表达情况以及6-MP或6-TG的IC50,用以验证293T细胞获得的药物敏感性实验结果.采用Annexin Ⅴ/DAPI双染法评估各REH细胞系的凋亡情况,并通过Western blotting检测各REH细胞系的DNA损伤相关蛋白[S139位点磷酸化的组蛋白H2AX(phosphorylated H2AX-S139,γ-H2AX)、磷酸化的细胞周期检验点激酶 2(phosphorylated check point kinase 2,pCHK2)]和细胞凋亡相关蛋白聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶剪切体[cleaved poly(ADP-ribose)polymerase,cleaved PARP]的表达水平.使用PDB数据库(Protein Data Bank)中编号为2HCR(PDB code 2HCR)的PRPS1晶体结构图,通过三维成像及PyMOL软件预测并绘制I72位点、I72V和I72F的氨基酸残基及空间构象图.结果·Western blotting结果显示,瞬时转染的外源性PRPS1各突变蛋白在293T细胞中成功表达;药物敏感性实验结果显示,表达PRPS1 I72F、R177S、V316L、V208A与阳性对照A190T的293T细胞对6-MP或6-TG的IC50 均远高于表达V289A及阴性对照Vector、PRPS1 WT、PRPS1 I72V的细胞(均P=0.000).将第72位异亮氨酸变成其他氨基酸后,Western blotting结果显示瞬时转染的外源性PRPS1 I72位点的各突变蛋白在293T细胞中成功表达;药物敏感性实验结果显示,表达PRPS1 I72M、I72F、I72L、I72N、I72S、I72T与A190T的293T细胞对6-MP或6-TG的IC50均远高于表达Vector、PRPS1 WT、PRPS1 I72V的细胞(均P=0.000).慢病毒感染REH细胞后,Western blotting结果显示在已构建的稳定细胞系中PRPS1 WT、A190T、I72F、I72V的蛋白高表达且表达量相似;药物敏感性实验结果显示,表达PRPS1 I72F、A190T的REH细胞对6-MP或6-TG的IC50均远高于表达Vector、PRPS1 WT、PRPS1 I72V的细胞(均P=0.000),与293T细胞中瞬时转染得到的药物敏感性结果一致.Annexin Ⅴ/DAPI双染法、DNA损伤和凋亡相关蛋白的Western blotting检测的结果均显示,经6-MP处理后,表达PRPS1 A190T、I72F的REH细胞系的DNA损伤和凋亡率明显低于表达Vector、PRPS1 WT、PRPS1 I72V的细胞(均P=0.000).蛋白结构分析结果显示,PRPS1 I72F会使PRPS1的空间构象发生改变.结论·PRPS1 I72F、R177S、V316L、V208A、I72M、I72L、I72N、I72S、I72T突变可使细胞获得对巯嘌呤类化疗药的耐药性,PRPS1 V289A、I72V突变不影响细胞对巯嘌呤类化疗药的敏感性.293T中的药物敏感性实验结果和REH中的药物敏感性实验结果一致,证明293T细胞可以作为检测PRPS1突变对巯嘌呤类化疗药物耐药性的快速研究模型.PRPS1 I72位点突变对巯嘌呤类化疗药耐药性的影响可能与PRPS1结构发生改变有关.

目的 观察应激性高血压(SIH)大鼠延髓胱硫醚-β-合酶(CBS)和3-疏基丙酮酸转硫酶(3-MPST)/硫化氢(H2S)合成途径的变化.方法 18只雄性WKY大鼠按照随机数字表法分为对照组(n=6)和SIH组(n=12).对照组大鼠不做任何处理,SIH组大鼠采用电击足底结合噪音刺激制作SIH模型.四道生理记录仪测定两组大鼠血压和心率,亚甲蓝法测量两组延髓H2S生成,蛋白质免疫印迹法检测对照组和SIH组大鼠延髓CBS和3-MPST蛋白的变化.结果 对照组大鼠的收缩压和心率分别是(119.21±6.49)mmHg和(326.40±13.54)次/min,SIH组大鼠的收缩压和心率分别为(147.16±9.76)mmHg、(402.51±19.28)次/min.与对照组比较,SIH组大鼠的收缩压和心率分别增加了23.45％和23.35％,差异均有统计学意义(P＜0.05).对照组和SIH组大鼠延髓H2S生成率分别是(1 492.76±121.67)pmol·min-1·mg-1、(247.96±107.17)pmol·min-1·mg-1,与对照组比较,SIH组大鼠延髓H2S生成率显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05).对照组大鼠延髓中CBS和MPST蛋白表达水平分别为2.98±0.43、0.77±0.14.应激刺激后,SIH组大鼠延髓CBS和MPST蛋白表达水平分别为2.20±0.18、0.56±0.16.与对照组比较,SIH组大鼠延髓CBS蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P＜0.05),MPST蛋白表达比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 SIH时H2S生成减少,其机制可能是延髓H2S生成酶CBS和3-MPST蛋白表达水平降低.

随着对硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)生理效应的研究,蛋白质硫巯基化(S-sulfhydration)修饰已进入人们的视野.已知依赖于H2S的蛋白质硫巯基化是继磷酸化(phosphorylation)、泛素化(ubiquitylation)、乙酰化(acetylation)和S-亚硝基化(S-nitrosylation)等之后的一种新的蛋白质翻译后修饰方式.对动物的研究表明,蛋白质硫巯基化修饰通过影响蛋白质活性和功能,从而在细胞内信号通路中发挥重要的调控作用.最近的研究结果提示,硫巯基化修饰还参与调节植物新陈代谢和形态建成.本文阐述了依赖于H2S的蛋白质硫巯基化的作用机制、检测方法和生理功能,并提出硫巯基化修饰也可能参与植物细胞信号转导的观点.

S-谷胱甘肽化(S-glutathionylation)是谷胱甘肽和靶蛋白半胱氨酸残基之间形成混合二硫化物的过程.由于其能调节靶蛋白功能,因此也属于蛋白质翻译后修饰.与其相对应,蛋白质的去谷胱甘肽化可由谷氧还蛋白(Grx)催化.因此,S-谷胱甘肽化修饰也被认为是一种防止蛋白质半胱氨酸巯基发生不可逆修饰的保护机制.由于该修饰还会改变含有巯基的氧化还原敏感型蛋白的结构与功能,因此也属于蛋白质功能调节的重要方式.哺乳动物细胞中S-谷胱甘肽化水平的改变与许多病理机制有关,但S-谷胱甘肽化在植物中的研究还处于起步阶段.本文综述了蛋白质的S-谷胱甘肽化的反应机制、检测方法、生理作用的相关研究进展,最后还提出今后研究中要解决的重要问题.

活性巯基在浸矿微生物硫代谢的过程中起着重要的作用,半胱氨酸残基作为蛋白质中活性巯基的提供者,为筛选硫代谢相关蛋白质基因提供了依据.本研究以极端嗜酸热古菌万座嗜酸两面菌A cidianus manzaensis为研究对象,基于其全基因组注释信息,筛选出编码富半胱氨酸残基的潜在硫代谢相关膜蛋白基因,并通过RT-qPCR实验对筛选出来的基因进行表达水平验证,同时利用生物信息学方法对其进一步分析.研究表明,与在亚铁中生长的细胞相比,单质硫培养下的细菌中与能量代谢相关的β-葡糖苷酶,与电子传递相关的ATP合成酶、NADH-辅酶Q氧化还原酶基因均表达上调,说明硫代谢途径可能与能量代谢和电子传递有着重要的联系.此外,还有三个假定蛋白基因表达上调,这三个假定膜蛋白中,ARM75161.1、ARM75436.1中的半胱氨酸都位于保守区域,且均有一个半胱氨酸残基暴露于膜外,而ARM75580.1中的半光氨酸不位于保守区域.其中ARM75436.1具有CXXXC结构域,且该结构域中半胱氨酸残基处于同一个β-折叠中.这些假定蛋白可能参与A.manzaensis中硫代谢途径.

肝脏是人体内最大的代谢器官,参与脂类、糖类和蛋白质等物质的合成与分解代谢.硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)是一种气体信号分子,参与调控多种病理生理过程.内源性H2S主要由胱硫醚β-合成酶(cystathionine β-synthase,CBS)、胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase,CTH)和3-巯基丙酮酸硫基转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,MST)催化合成,上述3种酶均存在于肝细胞中,通过催化产生的H2S参与调控肝脏功能.近年来大量研究表明肝脏中H2S的代谢影响脂蛋白合成,肝脏中H2S代谢紊乱与脂肪肝和肝硬化的发生发展密切相关.本文主要对H2S在肝脏脂代谢的生物学功能进行综述.

为研究酸法脱酰胺修饰对刺芹侧耳蛋白质的功能特性和消化性的影响,本研究以刺芹侧耳粉为原料,通过碱提酸沉法提取刺芹侧耳蛋白质,并采用0.175mol/L盐酸、57.5℃改性,改性时间为121min5s,制备出脱酰胺修饰蛋白质,探索脱酰胺改性对蛋白质的消化性及功能特性的影响.结果 表明:脱酰胺修饰可提高刺芹侧耳蛋白质的溶解性、持油性、起泡性和乳化性,但对其持水性的改善作用不明显;同时脱酰胺修饰蛋白质表面疏水性和荧光强度增大,蛋白质巯基和二硫键含量变化不明显;体外消化率提高,消化产物的多肽含量降低,游离氨基酸含量增大.酸法脱酰胺修饰可在一定程度上有效改善蛋白质的功能特性和提高蛋白质的体外消化水平.

S-亚硝基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式,是指一氧化氮(NO)基团共价连接至靶蛋白特定半胱氨酸残基的自由巯基,从而形成S-亚硝基硫醇(SNO)的过程.S-亚硝基化修饰广泛存在于各有机体中,通过改变蛋白质生化活性、稳定性、亚细胞定位以及蛋白质-蛋白质相互作用等机制而调控不同的生物学过程或信号通路.在蛋白质S-亚硝基化检测分析方法中,最为广泛使用的是生物素转化法(biotin switch assay),其基本原理是首先封闭未被修饰的自由巯基,进而将被修饰的SNO基团特异地还原为自由巯基并使用生物素将其特异标记.被生物素标记的半胱氨酸残基(即被修饰位点)可进一步通过蛋白质免疫印迹和/或质谱等方法进行检测分析.该文详细描述了植物蛋白质样品的体内和体外生物素转化法的实验流程,并对实验过程中的注意事项进行了讨论.

目的 克隆、表达伯氏疟原虫静息巯基氧化酶(Pb QSOX)基因,纯化重组PbQSOX蛋白(rPbQSOX),并对其生物信息学特点和酶活性进行分析. 方法 分别采用BLAST、SMART、ClustalW对PbQSOX蛋白的信号肽、蛋白结构域、活性位点、同源性进行分析;通过BLAST和MAGA5构建PbQSOX的系统进化树;应用SWISS-MODEL对PbQSOX蛋白的三级结构进行预测.BALB/c雌性小鼠经腹腔感染伯氏疟原虫(1×107/鼠),于感染后第4天提取疟原虫基因组DNA.PCR扩增PbQSOX基因,经测序正确后,将目的片段连接至原核表达载体pET30a(+),构建重组质粒pET30a(+)-PbQSOX.将鉴定正确的重组质粒转化至大肠埃希菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,取菌液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析;应用镍氨三乙酸琼脂糖柱纯化可溶性的rPbQSOX,并以三(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)为酶反应底物分析rPbQSOX的酶活性. 结果 BLAST分析结果鉴定出了PbQSOX大部分其他物种的同源基因.多序列蛋白比对与蛋白结构域分析结果显示,PbQSOX蛋白含1个信号肽,存在Trx1、ψErv和Erv/ALR结构域,但完全缺失了TⅨ2结构域.PbQSOX蛋白含3个关键的CXXC活化基序(C为半胱氨酸Cys,X为任意氨基酸),即CPAC、CRNC和CNYC;采用MAGA5邻接法构建的系统进化树显示,PbQSOX与约氏疟原虫QSOX(PyQSOX)的亲缘关系最近;SWISS-MODEL同源建模法分析结果显示,用已知的布氏锥虫QSOX(TbQSOX)可预测PbQSOX蛋白的三级结构.PCR扩增PbQSOX基因,获得1 486 bp目的条带,经测序为PbQSOX基因序列;pET30a (+)-PbQSOX质粒经N如Ⅰ、HindⅢ双酶切与测序鉴定正确.SDS-PAGE和Western bloting分析结果显示,rPbQSOX重组蛋白主要以可溶形式表达,相对分子质量约59 000.纯化后的rPbQSOX对TCEP的催化活性为0.84±0.18,DTT的催化活性为0.78±0.14 (P＜ 0.01). 结论 PbQSOX蛋白为单Trx1结构域的伯氏疟原虫静息巯基氧化酶,构建、表达的rPbQSOX蛋白为可溶性蛋白,具有一定的静息巯基氧化酶催化活性.