克雅病是一类由具有传染性的致病朊蛋白所致的致死性中枢神经系统变性疾病。该病早期临床表现多样，缺乏特异性，难以与其他中枢神经系统疾病相鉴别。目前，研究者们在克雅病的影像学、脑电图、脑脊液特殊蛋白检测等方面已经进行了长期的探索和临床实践，而近年来的致病朊蛋白检测新方法的发展更是为该病的早期诊断提供了巨大帮助，具有着极大的临床应用前景。笔者现围绕近年来克雅病的流行病学及分型、病因及病理机制，尤其是其早期诊断生物标志物等方面的研究进展进行综述，以期帮助临床同道进一步提高对克雅病的认识。

目的:探究咖啡酸苯乙酯（CAPE）对朊病毒（PrP Sc）复制、扩增及纤维形成的影响及可能的机制。 方法:通过CCK8实验检测CAPE处理3、7 d后朊病毒感染细胞模型SMB-S15的细胞活力，得出CAPE对SMB-S15的最大安全浓度；选取安全范围内的浓度处理细胞，利用蛋白质免疫印迹方法分析CAPE处理前后细胞内PrP Sc的含量变化。利用蛋白质错误折叠循环扩增（PMCA）技术和蛋白质免疫印迹方法检测CAPE处理前后扩增产物中PrP Sc的含量变化。利用实时震动蛋白诱导扩增（RT-QuIC）技术检测CAPE处理前后朊蛋白纤维形成的变化情况。通过分子相互作用检测CAPE与小鼠重组全长朊蛋白的结合能力。 结果:CCK8细胞活力实验结果显示：1 μmol/L CAPE处理细胞3、7 d时细胞存活率与对照组相比，差异无统计学意义（均 P>0.05），当CAPE浓度超过1 μmol/L时，CAPE处理细胞3、7 d细胞存活率降低，与对照组之间差异均存在统计学意义（均 P<0.05），因此1 μmol/L为CAPE处理SMB-S15细胞的最大安全浓度。蛋白质免疫印迹实验结果显示：CAPE处理3、7 d均可检测到SMB-S15细胞中PrP Sc含量的降低（均 P<0.05）。PMCA实验产物通过蛋白质免疫印迹方法检测结果显示：经CAPE处理后，适应株SMB-S15、139A、ME7的PMCA扩增产物中PrP Sc含量（相对灰度值）降低，与对照组相比差异有统计学意义（均 P<0.05）。RT-QuIC实验结果显示：CAPE处理后139A、ME7、SMB-S15小鼠适应株和朊病毒感染细胞SMB-S15在反应中形成朊蛋白纤维（ThT峰值）均降低，且CAPE对不同种子朊蛋白纤维的抑制程度差异有统计学意义（均 P<0.05），其中对ME7的抑制作用更明显。分子相互作用结果显示：CAPE与鼠源重组朊蛋白存在明显的分子结合，平衡解离常数KD为（2.92±0.41）×10 -6 mol/L。 结论:CAPE对PrP Sc体外复制、扩增和纤维形成均具有抑制作用，可能与CAPE和朊蛋白特异性结合有关。

朊病毒是一类能引起人或动物神经退行性疾病的感染因子.蛋白质错误折叠循环扩增(Protein misfolding cyclic amplification,PMCA)是一种常见的朊病毒体外扩增技术.白藜芦醇是一种具有较高研究价值的植物抗菌素.为了建立SMB-S15细胞中朊病毒的PMCA体系,并探索PMCA技术在评价白藜芦醇抗朊病毒作用的意义,本研究以朊病毒感染细胞系SMB-S15细胞匀浆为种子,健康小鼠脑组织匀浆为底物,建立PMCA技术平台.将不同浓度的白藜芦醇导入PMCA体系,通过Western Blot方法检测PMCA产物中异常朊蛋白(PrPSc)的生成和变化.结果 显示:SMB-S 15细胞中PrPSc可以在建立的PMCA体系有效地复制.新生成的PrPSc分子的糖基化特征与原始细胞中的PrPSc不同,其双糖基化分子比例明显增加.同时也有别于羊瘙痒因子139A和ME7感染小鼠脑组织中的PrPSc分子.加入白藜芦醇后,PrPSc在PMCA体系中的复制明显被抑制,呈现出剂量依赖效应,其EC50约为4.616 μM.这些结果表明:SMB-S15细胞中的PrPSc可以通过PMCA大量扩增,建立的PMCA技术可有效地反映白藜芦醇对PrPSc在体外复制的抑制作用.

克雅病(CJD)是一种由朊病毒侵袭人类中枢神经系统引起的传染性疾病,临床上主要表现为患者快速进行性痴呆.该病潜伏期长,病死率高.目前该病诊断金标准是活体脑组织检测,由于采样损伤和伦理问题在实际工作中极难开展.亟需找到一种可靠的实验室检测方法在发病早期对病例进行甄别,以便为非CJD患者寻求其他治疗方案,为确诊CJD患者采取对症治疗和医学防护.现在实验室检测主要集中在血液基因测序和脑脊液生物标志物(14-3-3蛋白、Tau蛋白、Aβ蛋白等)的检测.Tau蛋白是目前最准确的CJD单一标志物.实验检测方法方面实时震动诱导转化(RT-QuIC)和连续蛋白质错误折叠循环扩增(sPMCA)均能检出极低量的错误折叠蛋白聚合物,是目前最为可靠的早期人类阮蛋白疾病的实验室检测手段.但 Tau蛋白等生物标志物的研究目前还未达成世界范围内共识,需要更多的数据支持.

神经退行性疾病患者被诊断时通常已经处于疾病晚期,该类疾病的诊断主要取决于临床症状的鉴别,给诊断造成一定的困难.目前已经逐渐开始尝试对神经退行性疾病进行早期诊断.蛋白质体外扩增技术包括蛋白质错误折叠循环扩增(Protein Misfolding Cyclic Amplification,PMCA)和实时震动诱导转化(Real-time Quaking-induced Conversion,RT-QuIC),是用于检测错误折叠的蛋白质聚集体的超灵敏蛋白质扩增法.随着该类技术不断地改进,目前已逐渐应用于朊病毒病、突触核蛋白病、阿尔茨海默病和皮克氏病等疾病中错误折叠蛋白的检测.PMCA和RT-QuIC技术在临床症状出现前的早期阶段也显示出很高的检测灵敏度和特异性,并且可以进行鉴别诊断,这两种检测手段作为实验室辅助诊断方法,具有巨大的应用前景.

克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease,CJD)是一种在人类中最为常见的海绵状脑病,其致病因子为朊病毒.由于该病的致死率为100％,且具有传播风险,CJD的早期诊断对疾病防控具有重要意义.临床上一般依据患者的临床症状与体征以及相应的实验室检测来进行CJ D的鉴别诊断.本文主要围绕现有的CJ D实验室检测技术展开综述,包括朊病毒的直接与间接检测、疾病标志物的检测以及疾病相关基因PRNP的检测与分析等,旨在为进一步推广和规范CJ D的实验室检测提供参考与技术依据.

朊蛋白体外扩增技术包括实时震动诱导蛋白扩增(Real-time quaking-induced conversion,RT-QuIC)技术及蛋白错误折叠循环扩增(Protein misfolding cyclic amplification,PMCA)技术.为了分析朊蛋白体外扩增技术与传统的蛋白免疫印迹技术对于朊病毒毒株检测敏感性的差异,应用此三种方法对朊病毒小鼠适应株139A、ME7和S15以及仓鼠适应株263K毒株进行了检测及对比分析.结果显示,应用RT-QuIC方法以及三轮PMCA扩增方法,均可检测到10-9稀释度139A小鼠脑匀浆中的朊病毒,比Western blot方法敏感度提高了 106倍;应用RT-QuIC方法以及三轮PMCA扩增方法,分别可检测到10-7稀释度及10-8稀释度ME7小鼠脑匀浆中的朊病毒,分别比Western blot方法敏感度提高了 104倍及105倍;应用RT-QuIC方法以及三轮PMCA扩增方法,分别可检测到10-8稀释度及10-9稀释度S15小鼠脑匀浆中的朊病毒,分别比Western blot方法敏感度提高了 105倍及106倍;应用RT-QuIC方法可检测到10-9稀释度263K仓鼠脑匀浆中的朊病毒,比Western Blot方法敏感度提高了 106倍,但三轮PMCA扩增方法可检测到10-3稀释度的263K小鼠脑匀浆中的朊病毒,与Western Blot方法比较敏感度没有明显提高.本实验为优化朊蛋白体外扩增技术的检测条件、检测敏感性及该技术的临床应用提供了实验数据参考.