目的 探究人脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,hUCBMSCs)调控磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)通路对脑缺血再灌注损伤大鼠周细胞表达和神经功能变化的影响.方法 取雄性SD大鼠共72只,随机分组为假手术组、模型组、干细胞组、干细胞+抑制剂组,每组18只.除假手术组外,剩余各组均建立脑缺血再灌注模型.造模成功后,模型组尾静脉注射0.1 mL的磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate-buffered saline,PBS),干细胞组尾静脉注射0.1 mL含有2×106个hUCBMSCs的PBS,干细胞+抑制剂组尾静脉注射0.1 mL含2×106个hUCBMSCs的PBS及腹腔注射PI3K/Akt抑制剂LY294002(0.03 mg/100 g),LY294002每天给药1次,直至处死.术后1、3、7、14 d测定改良神经功能缺损评分(modified neurological severity scores,mNSS).术后7、14 d,采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色法检测大鼠脑梗死面积,尼氏染色检测大脑皮质缺血半暗带正常神经元细胞数,免疫组织化学法检测大脑皮质缺血半暗带血小板衍生生长因子受体-β(platelet derived growth factor receptor-β,PDGFRβ)阳性周细胞的数量,免疫印迹法检测大脑皮质缺血半暗带PI3K/Akt通路相关蛋白p-Akt及Akt的表达.结果 术后7d,4组各项指标整体差异均有统计学意义(P<0.001).与假手术组比较,模型组的大鼠正常神经元细胞数[(55.42±4.75)个vs.(8.50±1.64)个,P<0.001]和p-Akt/Akt(1.00±0.00 vs.0.47±0.06,P=0.002)均降低,脑PDGFRβ+周细胞数量[(1.08±0.29)个vs.(13.67±2.47)个,P<0.001]增加;与模型组比较,干细胞组大鼠的mNSS评分[(6.33±0.71)分vs.(4.78±0.98)分,P<0.001]和脑梗死率(32.66%±1.76%vs.14.60%±0.52%,P<0.001)均降低,正常神经元细胞数[(8.50±1.64)个vs.(23.17±1.77)个,P<0.001]、脑PDGFRβ+周细胞数量[(13.67±2.47)个vs.(28.50±3.19)个,P<0.001]和p-Akt/Akt(0.47±0.06 vs.0.83±0.18,P=0.017)均增加;与干细胞组比较,干细胞+抑制剂组的大鼠mNSS评分[(4.78±0.98)分vs.(6.11±0.78)分,P=0.002]和脑梗死率(14.60%±0.52%vs.27.85%±0.59%,P<0.001)均增加,正常神经元细胞数[(23.17±1.77)个vs.(11.83±0.88)个,P=0.003]、脑PDGFRβ+周细胞数量[(28.50±3.19)个vs.(20.33±1.44)个,P=0.007]和p-Akt/Akt(0.83±0.18 vs.0.36±0.11,P=0.003)均降低.术后14 d,4组各项指标整体差异均有统计学意义(P<0.001).与假手术组比较,模型组的大鼠正常神经元细胞数[(57.08±3.79)个vs.(11.25±5.52)个,P<0.001]和p-Akt/Akt(1.00±0.00 vs.0.53±0.12,P=0.002)均降低,脑PDGFRβ+周细胞数量[(2.00±0.25)个vs.(13.42±1.04)个,P<0.001]增加;与模型组比较,干细胞组大鼠的mNSS评分[(4.89±0.78)分vs.(2.33±0.87)分,P<0.001]和脑梗死率(32.58%±1.96%vs.11.78%±1.92%,P<0.001)均降低,正常神经元细胞数[(11.25±5.52)个vs.(31.00±1.89)个,P<0.001]、脑PDGFRβ+周细胞数量[(13.42±1.04)个vs.(31.42±3.66)个,P<0.001]和p-Akt/Akt(0.53±0.12 vs.0.93±0.12,P=0.004)均增加;与干细胞组比较,干细胞+抑制剂组大鼠的mNSS评分[(2.33±0.87)分vs.(4.44±0.53)分,P<0.001]和脑梗死率(11.78%±1.92%vs.25.25%±2.76%,P<0.001)均增加,正常神经元细胞数[(31.00±1.89)个vs.(13.83±1.04)个,P=0.002]、脑PDGFRβ+周细胞数量[(31.42±3.66)个vs.(20.67±1.42)个,P<0.001]和p-Akt/Akt(0.93±0.12 vs.0.53±0.09,P=0.005)均降低.结论 hUCBMSCs可能通过激活PI3K/Akt通路促进周细胞的存活募集,发挥神经保护的作用,进而促进脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能恢复.

目的:基于血小板衍生生长因子受体-β/磷脂酰肌醇 3 激酶/蛋白激酶B(PDGFR-β/PI3K/AKT)信号通路探讨改良型/注射型富血小板纤维蛋白(A-PRF、i-PRF)联合骨替代材料(Bio-Oss)修复大鼠牙槽骨缺损的作用机制.方法:大鼠自体取血获得A-PRF、i-PRF,制备A-PRF/Bio-Oss、A-PRF/i-PRF/Bio-Oss复合物.大鼠分为Con-trol组、A-PRF组、A-PRF/Bio-Oss组、A-PRF/i-PRF/Bio-Oss组,构建大鼠牙槽骨缺损模型,A-PRF组、A-PRF/Bio-Oss组、A-PRF/i-PRF/Bio-Oss组缺损处分别植入A-PRF、A-PRF/Bio-Oss、A-PRF/i-PRF/Bio-Oss复合物.于 1 个月后处死大鼠,并进行指标检测.Micro-CT、苏木精-伊红(HE)染色检测新骨形成情况;免疫组化染色、RT-qPCR检测牙槽骨组织成骨相关指标:Runt相关转录因子 2(Runx2)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、骨钙素(OCN)、I型胶原(Col I)和成血管相关指标:血小板-内皮细胞粘附分子(CD31)、血管内皮生长因子A(VEGFA)mRNA和蛋白表达;Western blot检测牙槽骨组织PDGFR-β/PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达.结果:A-PRF/i-PRF/Bio-Oss组牙槽骨新生骨量、新生血管、Runx2、BMP-2、OCN、Col I、CD31、VEGFA、PDGFR-β、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT表达量明显高于A-PRF/Bio-Oss组、A-PRF组、Control组(均P＜0.05).结论:A-PRF/i-PRF/Bio-Oss复合物通过促进骨形成和血管形成,促进大鼠牙槽骨缺损的再生修复,可能与激活PDGFR-β/PI3K/AKT信号通路有关.

目的:通过网络药理学方法,预测中药大黄抗肾脏纤维化的活性成分、潜在靶点及通路,选取活性成分,对筛选出的靶基因进行体外实验验证.方法:检索中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)与中药分子机制分析综合数据库(TCMID)获取并筛选大黄主要活性成分,利用相似度系综算法数据库(SEA),瑞士生物信息学研究所(SIB),GeneCards数据库预测和筛选大黄抗肾脏纤维化的潜在作用靶点.采用String Version 10.5数据库构建靶点蛋白相互作用(PPI)网络;运用David 6.8软件对关键靶点进行基因本体论(GO)富集分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析.采用CytoscapeVersion 3.6.0软件对关键蛋白相互作用网络、活性成分-关键靶点网络、活性成分-靶点-信号通路网络进行可视化分析.结合Malarcards数据库筛选出与肾脏纤维化高关联性信号通路.进一步采用细胞实验验证:选取HK-2细胞,利用转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导细胞纤维化模型,予大黄酸干预细胞48 h,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测缺氧诱导因子1α(HIF-1α),血管内皮生长因子(VEGF),血小板衍生生长因子受体-α(PDGFR-α),免疫荧光检测E-钙黏蛋白(E-eadherin),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡.结果:筛选得到大黄活性成分17个,大黄抗肾脏纤维化潜在靶点424个,关键靶点5个,依次为蛋白激酶B(Akt)1,丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)3,EGFR,白细胞介素-6(IL-6),VEGFA;GO富集生物学过程主要涉及信号转导、细胞增殖、凋亡等生物过程;KEGG通路富集结果发现磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt,HIF-1α,VEGF,叉头转录因子(FoxO)等通路与大黄抗肾脏纤维化作用机制相关.体外实验验证表明,大黄酸抑制E-cadherin,α-SMA,HIF-1α,VEGF,PDGFR-α的表达水平,同时抑制肾小管上皮细胞凋亡,验证了网络药理学部分预测结果.结论:本研究体现了大黄多成分、多靶点、多途径的作用特点,其抗肾脏纤维化的作用机制可能与其抑制HIF-1 α/VEGF/PDGFR-α信号转导途径,抑制细胞凋亡及肾小管上皮细胞上皮间质转化(EMT)有关.