目的:评价脑脊液二代测序在脑囊虫病诊断中的应用价值。方法:收集2019年6月至2022年1月在郑州大学人民医院诊断为脑囊虫病的6例患者，对其临床表现、实验室及影像检查、脑脊液二代测序结果进行综合分析。结果:6例患者的主要症状为癫痫、颅内高压、局灶神经功能缺损、精神行为异常、意识障碍等。脑脊液化验示：颅内压正常或升高，白细胞计数正常或增多，以单个核细胞为主，蛋白质含量正常或增高。影像学可累及脑膜或脑实质，可出现囊性病灶、环形或片状强化、脑积水。6例患者常规实验室病原学均阴性，3例患者血清囊虫抗体阳性，3例患者脑脊液二代测序检测出链状带绦虫序列。结论:二代测序能够提供脑脊液病原学线索，辅助脑囊虫病的诊断。

目的 开发基于PCR结合簇状规则间隔短回文重复序列及相关蛋白Cas12a(CRISPR/Cas12a)快速检测华支睾吸虫囊蚴的方法.方法 使用内转录间隔区(ITS)引物以华支睾吸虫基因组DNA为模板进行PCR扩增,取PCR扩增产物、Cas12a蛋白、crRNA、单链DNA(ssDNA)报告分子和焦碳酸二乙酯水,选择其中1～5个试剂,分别制备5个CRISPR反应体系,在紫外光下观察反应结果,验证PCR-CRISPR/Cas12a检测系统的可行性.设计5个浓度梯度(100、200、300、400、500 nmol/L)优化ssDNA报告分子浓度;保持 crRNA 浓度为 50 nmol/L,设计 5 个比例梯度(1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1)优化 Cas12a/crRNA比例,荧光定量PCR仪检测荧光信号.将重组质粒梯度稀释为10个不同浓度(10-2～107拷贝/μl),PCR扩增、CRISPR反应后检测荧光信号,评价检测系统的灵敏度.提取华支睾吸虫囊蚴、东方次睾吸虫囊蚴、猬迭宫绦虫裂头蚴、派氏异尖线虫和亚洲带绦虫节片基因组DNA,PCR扩增、CRISPR反应后检测荧光信号,评价检测系统的特异性.压片镜检华支睾吸虫病流行区捕获的小型淡水鱼鱼肉,分别挑选出华支睾吸虫囊蚴、东方次睾吸虫囊蚴和其他囊蚴(未鉴定出虫种)等3种囊蚴混合感染,华支睾吸虫和东方次睾吸虫囊蚴的混合感染,华支睾吸虫和其他囊蚴的混合感染,东方次睾吸虫和其他囊蚴的混合感染,单华支睾吸虫囊蚴感染,单东方次睾吸虫囊蚴感染,单其他囊蚴感染和无囊蚴感染等8种鱼肉样品组织,提取DNA后进行PCR-CRISPR/Cas12a检测,在紫外光下观察反应结果.使用GraphPad prism 9.0软件对数据进行单因素方差分析,两两比较采用图基多重检验.结果 完整的PCR-CRISPR/Cas12a检测系统能够在紫外光下产生荧光信号.ssDNA报告分子浓度为400nmol/L时,反应体系的荧光值为(40 786±1 758)AU,高于300nmol/L的(32 029±2 651)AU(P＜0.05),与 500 nmol/L 的(42 698±4 260)AU 差异无统计学意义(P＞0.05),选取ssDNA报告分子浓度为400 nmol/L.Cas12a/crRNA比例为2.0∶1时,反应体系的荧光值为(48 950± 3 723)AU,高于 1.5:1的(37 700±3 887)AU(P＜0.05),与 2.5∶1 的(55 630±3 110)AU 差异无统计学意义(P＞0.05),选取Cas12a/crRNA比例为2.0∶1.灵敏度检测结果显示,重组质粒的浓度为10-1拷贝/μl时,反应体系的荧光值为(39 336±7 231)AU,与阴性对照的(2 216±743)AU差异有统计学意义(P＜0.05);当浓度降至10-2拷贝/μl时,荧光值为(5 451±1 957)AU,与阴性对照的差异无统计学意义(P＞0.05).特异性检测结果显示,ITS引物能同时PCR扩增华支睾吸虫、东方次睾吸虫、猬迭宫绦虫、派氏异尖线虫和亚洲带绦虫等5种基因组DNA;相同扩增产物的CRISPR检测结果显示,仅以华支睾吸虫基因组DNA为模板的反应体系在紫外光下产生了荧光信号.PCR-CRISPR/Cas12a效果评价检测结果显示,8种不同囊蚴感染的鱼肉样品反应体系中,含有华支睾吸虫囊蚴的4管出现荧光信号.结论 本研究建立了华支睾吸虫囊蚴的PCR-CRISPR/Cas12a检测方法,该方法灵敏度高、特异性好、高度模块化,具有较好的现场应用潜力.

诊治分析宁海县首例带绦虫感染病例,并鉴定感染虫种.对患者开展流行病学调查,收集患者主要临床表现、生活习惯等资料.采集患者粪样,制备生理盐水涂片,观察虫卵形态.使用槟榔南瓜子进行驱虫治疗,对患者排出的虫体进行形态学观察.利用PCR技术扩增虫体DNA的线粒体细胞色素c氧化酶1(cox1)基因片段并进行序列分析.流行病学调查结果显示,患者无外出旅行史和生食史,仅2017年9月初曾食过未完全煮熟的牛肉.于2017年11月10日出现腹泻、易饥饿现象;11月26日,肛周首次排出长约30 cm、白色、扁平状、类似面条样的节片;12月4日,肛周再次排出长约2 cm的多节节片,遂至宁海县中医院诊治,诊断为“疑似带绦虫病”.粪样镜检结果显示,可见虫卵,内含六钩蚴,未见卵膜.对排出的成虫进行形态学鉴定:虫体前端细长,向后逐渐变粗变宽变厚,由颈节和链体节片连接而成,未发现头节;孕节子宫分支整齐,每侧约24～28支,总长5.32 m,疑似牛带绦虫.cox1基因经PCR扩增后,可获得长度为832 bp的目的条带.测序后的BLAST比对分析结果显示,目的条带与牛带绦虫(Taenia saginata,GenBank登录号为AB107239.1)cox1基因序列的同源性为99％,与亚洲带绦虫(Taenia asiatica,GenBank登录号为AB107235.1)和猪带绦虫(Taenia solium,GenBank登录号为AB066485.1)cox1基因序列的同源性分别为96％和88％.综合患者的流行病学调查、虫体形态学观察、cox1基因序列比对的结果,确诊该患者属于食用未煮熟牛肉引起的牛带绦虫感染.

牛带绦虫又称肥胖带绦虫、无钩绦虫.牛带绦虫和猪带绦虫(即猪肉绦虫或链状带绦虫)同属于圆叶目、带科、带属,在我国主要流行于西藏、新疆、云南等少数民族居住的农牧区[1-2].山东省临沂市人民医院首次发现1例牛带绦虫病例,现将病例的治疗与转归情况报道如下.

目的 建立一种多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction,mPCR)方法,用于快速鉴别猪囊尾蚴等4种猪的绦虫蚴.方法 比较猪带绦虫(Taenia solium)、亚洲带绦虫(Taenia asiatica)、细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)和泡状带绦虫(Taenia hydatigena)的线粒体基因组,选取tRNA-Val、tRNA-Ala、tRNA-Asp和nad1基因作为分子检测靶标,设计4条种特异性上游引物(TaF、EgF、ThF、和TsF)和1条下游通用引物(TR),通过优化反应条件和体系,建立了在一个PCR体系中即可完成对4种猪绦虫蚴的快速鉴别的mPCR方法.结果 4种猪绦虫蚴的特异性PCR引物等比例混合后,在退火温度为50℃的条件下,该mPCR方法可同时扩增出C.cellulosae、T.asiatica、E.granulosus和C.tenuicol-lis的特异性基因片段,其大小分别为478 bp、710 bp、619 bp和542 bp.PCR产物测序后经BLAST比对,与同种虫体的基因序列相似性在99％以上.结论 本研究建立的mPCR方法具有很高的种间特异性,并且可通过扩增片段的大小对4种猪绦虫蚴进行快速、准确的鉴别.