间充质干细胞在基因以及微环境的时空调控下可自发聚集形成致密化区域，这一现象称为间充质凝聚。间充质凝聚是跨物种保守的发育事件，对启动牙及全身器官的形态发生至关重要。间充质干细胞在培养中也具有自组装聚集能力，利用此特性构建干细胞聚合体以模拟发育性间充质凝聚已成为一种具有应用前景的再生医学手段。本文讨论间充质凝聚的原理及其在牙形态发生中的作用与机制，并总结干细胞聚合体的工程化构建策略及应用于牙再生领域的实践经验，旨在从“发育指导再生”的理念出发，为理解干细胞发育生物学和建立新的器官再生策略提供参考。

目的 探讨RGD多肽修饰的酰化海藻酸钠水凝胶基质能否调节骨髓间充质干细胞(BMSCs)的行为活性并促进其成软骨向分化.方法 RGD多肽通过迈克尔加成反应接枝于酰化的海藻酸钠.光引发剂与酰化海藻酸钠的双键在紫外光照射下交联成胶.通过CCK-8实验、扫描电镜、细胞骨架染色、免疫荧光染色、Western blot和RT-PCR评价功能化水凝胶对BM-SCs增殖、成软骨向分化的作用.结果 相较于未接枝组,RGD多肽修饰的酰化海藻酸钠水凝胶可以促进基质内BMSCs形态延展并出现聚集.接枝RGD多肽后,无论在二维还是三维培养体系中,BMSCs的增殖活性明显高于未接枝组.经过成软骨诱导培养后,RGD多肽修饰的酰化海藻酸钠水凝胶可以更好地促进BMSCs凝聚和成软骨向分化.结论 接枝RGD多肽的酰化海藻酸钠水凝胶可以更好地促进BMSCs增殖、成软骨向分化.

目的 构建SHP2E76K突变的小鼠模型,利用其间充质干细胞(MSC)研究激活突变引发的SHP2蛋白相分离对其细胞增殖能力的影响及其机制.方法 将Ptpn11E76K-neo/+的C57BL/6J小鼠与Mx1-cre工具鼠杂交,得到所需要的Mx1-cre;Ptpn11+/+和Mx1-cre;Ptpn11E76K/+小鼠,并对后者注射pI-pC以诱导Cre酶的表达,使Ptpn11在骨髓MSC中突变.从Mx1-cre;Ptpn11+/+和Mx1-cre;Ptpn11E76K/+小鼠体内分离培养MSC,通过细胞免疫荧光染色确定所分离的细胞为MSC.以Ptpn11+/+的MSC为对照组,Ptpn11E76K/+的MSC为实验组,通过加药将两种细胞分成6组:Ptpn11+/+组;Pt-pn11+/++SHP099组;Ptpn11+/++ET070组;Ptpn11E76K/+组;Ptpn11E76K/++SHP099组;Ptpn11E76K/++ET070组.免疫荧光染色法观察6组细胞内SHP2蛋白相分离的差异,Western blot法检测6组MSC中SHP2蛋白表达水平的差异.CCK-8检测相分离被影响之后细胞增殖能力的改变.提取实验组与对照组细胞总蛋白通过Western blot法检测ERK/p-ERK、AMPK/p-AMPK、mTOR/p-mTOR等蛋白的表达水平.结果 小鼠基因型鉴定证实得到Mx1-cre;Pt-pn11E76K/+和Mx1-cre;Ptpn11+/+小鼠并分离出原代Pt-pn11+/+和Ptpn11E76K/+骨髓MSC.与Ptpn11+/+组相比,Pt-pn11E76K/+组的SHP2蛋白产生更多的相分离冷凝物;与Pt-pn11E76K/+组相比,Ptpn11E76K/++SHP099组和Ptpn11E76K/++ET070组SHP2蛋白凝聚成的冷凝物在均明显减少;Western blot检测各组SHP2蛋白表达水平差异无统计学意义;与Pt-pn11+/+组相比,Ptpn11+/++SHP099组和Ptpn11+/++ET070组MSC的增殖能力下降,细胞内p-ERK和p-mTOR蛋白表达减少,p-AMPK蛋白表达增加;与Ptpn11E76K/+组相比,Ptpn11E76K/++SHP099组和Ptpn11E76K/++ET070组MSC的增殖能力下降,细胞内p-ERK和p-mTOR蛋白表达减少,p-AMPK蛋白表达增加.结论 SHP2的相分离通过刺激AMPK-mTOR信号通路的表达参与了SHP2E76K激活突变的MSC的增殖能力改变.

目的:三维重建小鼠牙发育早期牙胚的形态结构,对比无牙区发育不全的牙胚(rudimentary bud 2,R2)与磨牙区第一磨牙(the first molar,M1)牙胚的形态差异.方法:选取胚胎 12.5 d(E12.5)及胚胎 13.5 d(E13.5)小鼠胚胎头部标本,经冠状面连续石蜡切片、苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色后,获取组织学图像数据.图像经Photoshop CC 2018 软件处理并配准,用Fiji软件再配准与赋予虚拟CT值后,导入Mimics Research 19.0 软件进行三维重建和分析.结果:在重建的三维图像中观察到无牙区R2 上皮可向间充质内陷形成蕾状,但其下方无明显的间充质细胞团形成.赋予无牙区R2 和磨牙区M1 虚拟CT值后,对重建图像进行半定量测量,发现凝聚在无牙区R2 蕾状上皮周围的间充质细胞密度较低,凝聚面积较小.此现象可能与无牙区细胞增殖不如磨牙区活跃有关.结论:基于组织学切片的三维重建结果提示,发育早期小鼠无牙区丧失了形成间充质细胞团的能力.

以牙缺损、缺失和颌面部骨组织缺损等为代表的牙颌组织缺损在口腔颌面部疾病中十分常见,目前的治疗方式包括自体或同种异体组织移植、人工合成材料的仿真替代等,不能实现生理性的牙颌组织结构和功能的修复.间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有广泛而强大的再生医学应用潜能,基于间充质凝聚发育原理的干细胞聚合体技术,其具有维持细胞干性、重塑再生微环境和重启组织分化的功能特性,已经成功应用于牙髓、牙周、骨组织的再生修复,并在相关临床试验中取得良好效果,具有较好的临床转化前景.本文将从干细胞聚合体的制备原理、构建方式和转化应用等方面进行探讨,以期为更好实现牙颌组织缺损的再生修复提供新的理论依据和治疗策略.

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分泌的外泌体(exosomes)对脊髓损伤大鼠行为学、损伤处活化星形胶质细胞和残余神经元数量的影响,初步探索BMSCs-exo-somes作为脊髓损伤的细胞替代疗法的可行性.方法:采用全骨髓培养法培养 BMSCs,流式细胞术鉴定其表面标志CD90和CD34.收集BMSCs上清液,超速离心法提取并标记外泌体,电镜观察其结构,Western blot法检测其 CD63和CD9的表达水平.将外泌体作用于脊髓损伤大鼠,于损伤后各时点进行后肢运动功能评价,并于预定时点处死大鼠取损伤脊髓段,尼氏染色法观察损伤脊髓形态,免疫荧光法检测反应性星形胶质细胞和残余神经元的数量.结果:BMSCs分泌的外泌体电镜下呈"茶托状"结构,Western blot法检测其阳性表达CD63和CD9.脊髓损伤后14 d和28 d治疗组神经功能有一定程度改善,与损伤组间差异有统计学意义(P<0.05).损伤后14 d治疗组较之损伤组的尼氏体结构更完整、分布更匀称,崩解凝聚减少.治疗组损伤后7 d、14 d和28 d反应性星形胶质细胞数量较损伤组明显降低(P<0.05).损伤后7 d、14 d和28 d治疗组残余神经元数量高于相应时点损伤组(P<0.05).结论:BMSCs分泌的外泌体可减少脊髓损伤区域反应性星形胶质细胞的数量,减少神经元的死亡,有利于损伤后后肢运动功能改善.

[目的]探讨非染色体结构维护亚基(SMC)凝聚素Ⅰ复合物亚基G(NCAPG)基因在结直肠癌中的表达及临床意义.[方法]利用Oncomine数据库、GEPIA数据库、UALCAN数据库等分析NCAPG在结直肠癌及正常组织中表达的差异,并分析其与临床相关指标之间的关系.利用GEPIA、GSCA数据库分析NCAPG的表达水平与结直肠癌患者预后的关系,利用TIMER数据库分析NCAPG与免疫浸润细胞的相关关系,利用GSCA数据库对NCAPG在肿瘤通路活性情况进行分析.[结果]NCAPG基因在结直肠癌组织中表达上调,并且NCAPG表达水平与肿瘤的临床分期、淋巴结分期相关,NCAPG表达水平升高的患者拥有更好的总生存期(OS)、无进展生存期(PFS).NCAPG可促进CD8+T细胞的表达,NCAPG在结直肠癌中与细胞凋亡、细胞分裂、上皮细胞-间充质转化(EMT)以及雌激素受体(ER)相关,CCNB1基因是其共表达基因.[结论]NCAPG基因在结直肠癌中表达增高,且NCAPG基因的高表达的患者预后更好,可作为结直肠癌的预后生物标志物,进一步的实验及临床试验对进一步阐明NCAPG基因在结直肠癌中的价值至关重要.

目的·研究低剂量地西他滨对原发免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)患者来源的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)增殖、凋亡等生物学行为的影响.方法·纳入2020年4月-2021年10月上海交通大学医学院附属仁济医院血液科门诊或住院的ITP发病期患者10例,以及10例无骨髓异常的非ITP患者作为对照(normal control,NC),收集骨髓穿刺标本,分离MSC,流式细胞术检测其表面抗原标志物.使用CCK-8试剂盒和EdU细胞增殖检测试剂盒检测及比较ITP患者来源(MSC-ITP)和对照组来源(MSC-NC)的MSC增殖水平差异,并使用微管荧光探针检测细胞形态的变化.使用Hoechst 33258染色观察细胞凋亡情况,采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒检测细胞凋亡水平.通过不同浓度的地西他滨以不同的时长处理MSC-ITP,探索地西他滨促其增殖的最佳浓度及处理时间.以最佳浓度的地西他滨处理MSC-ITP,观察其对细胞凋亡水平的影响.Western blotting检测细胞凋亡相关通路蛋白的表达,以及地西他滨的影响.结果·与MSC-NC相比,MSC-ITP细胞形态异常,细胞核碎裂、皱缩较多,体外增殖水平减弱,基础凋亡率增加.地西他滨刺激MSC-ITP增殖的最佳工作浓度为2.5 μmol/L,最佳处理时间为24 h.2.5 μmol/L地西他滨处理MSC-ITP 24 h后细胞核形态得到改善,细胞核的碎裂和凝聚减少,凋亡率显著降低(P＜0.05).Western blotting结果表明,地西他滨处理后,MSC-ITP中线粒体凋亡通路相关蛋白BAX降低,胱天蛋白酶(caspase3)和cleaved-caspase3减少(均P＜0.05).结论·ITP患者骨髓来源的MSC形态异常,体外增殖水平减弱,基础凋亡率增加;低剂量地西他滨可以促进该细胞增殖,抑制其凋亡;该作用可能是通过线粒体凋亡途径介导的.