目的 设计并制备mRNA-多肽-泊洛沙胺纳米颗粒(mRNA peptide polymer ternary complex,mRNA-PPTC),考察其理化特性、体外和体内呼吸道组织相关细胞递送效率、免疫后小鼠特异性抗体诱导能力.方法 通过体外转录分别制备编码萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,F-luc)、增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和新冠病毒受体结合域蛋白(receptor binding domain,RBD)的mRNA,利用动态光散射法检测mRNA-PPTC的粒径、多分散系数、Zeta电位.通过透射电镜观察纳米颗粒形态.将F-luc mRNA-PPTC及对照组制剂分别转染至人支气管上皮细胞(16 human bronchial epithelial cell,16HBE)、鼠源树突状细胞(dendritic cell 2.4,DC2.4)、鼠源巨噬细胞(mouse leukemia cells of monocyte macrophage,RAW264.7),检测荧光素酶报告基因转染效率和细胞活性;将EGFP mRNA-PPTC及对照组制剂转染至16HBE细胞,使用荧光显微镜观察EGFP表达情况.利用活体成像技术考察F-luc mRNA-PPTC在小鼠呼吸道的转染效率.选用编码RBD蛋白的mRNA作为疫苗抗原模型,通过酶联免疫吸附实验检测免疫后小鼠血清中抗原特异性免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)和支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中抗原特异性分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)水平.结果 成功制备粒径约100 nm近球形且均一稳定的弱阳离子mRNA-PPTC纳米颗粒;mRNA-PPTC能有效转染16HBE、DC2.4、RAW264.7细胞,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01),并且细胞毒性较低;mRNA-PPTC通过滴鼻免疫后,在小鼠鼻部和肺组织中检测到F-luc报告基因的有效表达,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);在初免后第28天的小鼠血清和BALF样品中,能分别检测到高效价的RBD抗原特异性IgG和sIgA,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05).结论mRNA-PPTC纳米颗粒有良好的体外mRNA递送能力且细胞毒性较低;滴鼻给药后在小鼠上下呼吸道均能高效表达目的基因;小鼠滴鼻免疫后能产生高水平的抗原特异性血清IgG和支气管肺泡灌洗液sIgA.

目的 分析载双基因的阳离子纳泡联合超声靶向微泡破坏技术进行基因转染的有效性,探索恢复或上调膀胱癌细胞的缝隙连接蛋白connexin26(Cx26)表达,能否增强自杀基因系统(yeast cytosine deaminase/5-fluorocytosine,YCD/5-FC)的旁观者效应,提高杀灭肿瘤细胞的效率.方法 阳离子纳泡结合超声辐照(US)转染人膀胱癌T24细胞,荧光显微镜及流式细胞仪观测转染效率;qRT-PCR和Western blot检测质粒转染后的mRNA或蛋白相对表达量.将实验分为兀处理空白对照、载pcDNA3.1-EGFP纳泡组、载Cx26纳泡组、载YCD纳泡组、载YCD+ Cx26纳泡组;通过流式细胞术观察恢复Cx26表达后对膀胱癌细胞凋亡的影响.结果 qRT-PCR、Western blot显示纳泡结合超声辐照成功将目的基因转染并有效表达.恢复Cx26表达后,载YCD+Cx26纳泡组的细胞凋亡率为(60.68±2.61)％,明显高于单载YCD纳泡组的(46.42±2.13)％,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 恢复缝隙连接蛋白Cx26表达,可改善细胞间通讯连接,加强自杀基因系统YCD/5-FC的旁观者效应,促进肿瘤细胞凋亡,提高杀灭膀胱癌细胞的效率.

目的 探讨钛表面儿茶酚化聚电解质多层膜对蛋白质的吸附行为,为钛种植体表面改性提供参考.方法 根据本课题组前期建立的方法,采用脂多糖胺纳米囊泡(NPs)和3,4-二羟苯基丙酸反应制备儿茶酚接枝率为40％的儿茶酚化NPs(cNPs);采用透明质酸(HA)和多巴胺反应制备儿茶酚接枝率为10％的儿茶酚化透明质酸(cHA).利用层层自组装技术,以cNPs为引发层、cHA/NPs为阴、阳离子聚电解质,在钛或石英表面构建含3个(cHA/NPs)双层的儿茶酚化聚电解质膜[(基底-cNPs-(cHA/NPs)3],记为cPEM.同时以NPs为引发层,构建含(HA/NPs)3的未儿茶酚化聚电解质膜(PEM).采用红外光谱分析膜表面化学组成、激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测膜表面粗糙度,Zeta电位分析仪记录膜表面Zeta电位.选取4种等电点(pI)分别小于、等于、大于生理pH 7.4的蛋白质:牛血清白蛋白(BSA,pI=4.7)、纤连蛋白(Fn,pI=5.8)、牛血红蛋白(BHb,pI=6.8～7.0)、多聚赖氨酸(PLL,pI=9.74),以其为模型蛋白,用0.15 mol/L的NaCl配制成1 mg/mL的水溶液.采用石英晶体微天平(QCM)实时动态监测膜表面蛋白吸附情况、原子力显微镜观察样品蛋白吸附前后形貌,LSCM、荧光酶标仪分别分析荧光标记蛋白在膜表面吸附情况,并测试荧光标记蛋白的吸附量.使用SPSS 20.0对数据进行单因素方差分析、SNK和LSD法进行比较,P<0.05认为差异有统计学意义.结果 LSCM结果表明,石英表面粗糙度为(301±12)nm,组装cPEM、PEM后,表面粗糙度增加,分别为(656±88)、(446±25)nm,组间差异具有统计学意义(F=66.974,P<0.001).cPEM组的红外谱图中出现儿茶酚中的苯环(νC=C)、PEM组的胺基和烷基、多糖中的糖醛酸环等特征峰,证实钛表面引入cPEM和PEM.组装过程中Zeta电位呈锯齿状交替上升,cPEM组表面电位为+22.53 mV,PEM组的表面电位为+17.36 mV.QCM结果表明,生理pH下,所有表面均基本不吸附PLL.在不同表面,BSA和BHb的吸附量cPEM组>PEM组>Ti组.原子力显微镜下可见cPEM、PEM组表面为分布均匀的水滴形海岛状结构,吸附BSA后,表面可见圆盘状结构,且cPEM组量大于PEM组,说明可能BSA在cPEM组表面的吸附量大于PEM组.采用LSCM和荧光酶标仪分析绿色荧光标记蛋白在不同表面的吸附情况,发现在不同种膜表面,同一蛋白吸附量cPEM组>PEM组>Ti组;在同一种膜表面,不同蛋白吸附量BSA>Fn>BHb.结论 本实验研发的聚电解质多层膜对钛表面进行改性后,能提高蛋白在表面的吸附,儿茶酚化改性则进一步促进这种吸附.蛋白吸附的驱动力可能主要源于静电相互作用和儿茶酚基团对蛋白偶联捕捉作用.

目的 制备并优化阳离子载体脂多糖胺纳米囊泡(lipopolysaccharide-amine nanopolymersomes, LNPs)性能,探讨其负载靶基因后体外诱导BMSCs定向成骨分化能力.方法 采用接枝共聚的方法合成LNPs,探讨合成时不同pH (7.5、8.0、8.5、9.o)对LNPs及LNPs/pBMP-2-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)复合物理化性能的影响;通过体外大鼠BMSCs细胞毒性及转染实验,筛选出具低毒高转染效能的LNPs,再用其负载pBMP-2-GFP基因转染大鼠BMSCs,通过定期观察细胞形态、测定细胞表达BMP-2蛋白水平和ALP活性、钙结节生成情况来评价LNPs/pBMP-2-GFP对BMSCs成骨分化的影响.结果 pH为8.5时合成的LNPs含氮量、粒径及zeta电位均低于其余pH值组,其细胞毒性最低(细胞成活率96.5％±1.4％)、转染效率最高(98.8％±0.1％).BMSCs经LNPs/pBMP-2-GFP转染诱导处理后,在前4d内,其BMP-2蛋白表达量均明显高于Lipofectamine2000(Lipo)/pBMP-2-GFP组、支链型聚乙烯亚胺25K/pBMP-2-GFP组和空白对照组(P＜0.05).诱导后14d其ALP活性高于Lipo/pBMP-2-GFP组和空白对照组(P＜0.05),与成骨诱导液处理组相当(P＞0.05);茜素红染色显示其和成骨诱导液处理组细胞出现明显钙结节,而Lipo/pBMP-2-GFP组和空白对照组细胞出现凋亡、未见明显钙结节;诱导后21d镜下观察见细胞中出现透明块状结节,呈成骨细胞形态特点.结论 pH为8.5时合成的LNPs具有低细胞毒性、高转染效率,能高效介导BMP-2基因转染大鼠BMSCs,并成功诱导BMSCs成骨定向分化,其成骨诱导效果与成骨诱导液处理相当.LNPs介导的基因转染可能是诱导干细胞定向分化的一种简便有效的手段.

目的 探讨超声破坏载pcDNA3-bFGF-NGF基因纳泡对糖尿病大鼠烫伤创面的治疗作用.方法 制备载pcDNA3-bFGF-NGF基因纳泡,检测其基本特性;MTT法检测其对大鼠真皮成纤维细胞活性的影响;Western-blot检测其在大鼠真皮成纤维细胞中的基因表达水平及转染效率.选取糖尿病大鼠27只,分为空白对照组、载基因纳泡组及超声破坏载基因纳泡组,超声破坏载基因纳泡组又分别于1d、2d、3d、4d、7d、14d及21d观察创面愈合情况,以及bFGF及NGF蛋白表达水平及转染效率,并与空白对照组、载基因纳泡组21 d时的结果 进行对照.结果 所制备的阳离子纳泡形态规则,稳定性好,平均表面电位为12.7 mV;与基因结合量高达3.8 mg/108个纳泡;基因结合率高达39.5％;MTT显示对细胞无明显毒性.Western-blot半定量结果显示,空白对照组和载基因纳泡组bFGF及NGF蛋白水平低;bFGF蛋白及NGF蛋白在载基因纳泡组48 h时转染效率及表达水平最高.超声破坏载基因纳泡48 h组bFGF水平在治疗第7天表达及转染率达到峰值,NGF水平在治疗第4天表达及转染率最高.结论 载pcDNA3-bFGF-NGF基因纳泡能显著增强超声显影;经超声基因转染仪破坏后可定位释放基因,且基因转染效率明显提高,对糖尿病大鼠烫伤创面有较好的治疗效果.

细菌和古细菌中发现的成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)系统是通过CRISPR RNA引导核酸内切酶特异性断裂靶基因,借助同源重组和非同源末端连接修复基因组DNA,引入碱基序列的插入、缺失或替换,实现定向基因编辑的一个工具.它的出现为多个学科领域的基础研究带来极大的便利,也为临床治疗基因疾病提供了一种方式.两个主要功能组分只有进入细胞核才能发挥作用,由于细胞内和细胞外的多重障碍,高效递送CRISPR/Cas到靶组织或靶细胞仍是一个巨大的挑战,递送效率低限制了该技术的临床转化.多种递送方式中,非病毒载体与病毒载体、物理递送相比,具有独特的优点,许多学者投入了大量时间和精力设计性质优良的非病毒递送系统,包括阳离子脂质体、类脂纳米粒、阳离子聚合物、囊泡、金纳米粒、多肽和蛋白等.本文对CRISPR/Cas9的作用机制,基于质粒、mRNA和RNP的基因编辑实现方式、这些方式面临的困难和非病毒载体的研究进展进行了总结.

目的:制备载胞苷脱氨酶-胸腺嘧啶激酶(colicytocinedeaminase-thymidinekinase,CD-TK)双自杀基因纳泡,用于治疗膀胱癌小鼠.方法:采用薄层法制备载CD-TK双自杀基因纳泡,合成CD-TK双自杀基因阳离子纳泡,光镜观察纳泡的形态,马尔文粒径仪测其粒径;建立裸鼠后膀胱癌模型,超声辐照肿瘤部位,转染双自杀基因,按实验分组每组连续腹腔注射无毒前药1周,开始记录每只裸鼠肿瘤的最长径和最短径,计算并记录肿瘤的体积变化;第5周取裸鼠肿瘤标本,免疫荧光评估肿瘤组织切片细胞凋亡和增殖情况.结果:本研究成功制备了载CD-TK双自杀基因纳泡.通过超声介导载CD-TK纳泡成功转染自杀基因,抑制肿瘤增殖和促进肿瘤凋亡.结论:载CD-TK纳泡可能成为治疗膀胱癌的一种新方式.

局部点药是眼部用药最常见的方式,但一般药物通过角膜困难,药物生物利用度低.纳米载体药物于80年代开始用于眼部,脂质体和类脂质囊泡(niosomes)与眼表的黏蛋白相互作用,延长药物在眼表的停留时间.纳米乳剂(nanoemulsion)的表面活性剂可以松解角膜上皮细胞紧密连接,形成转运开口,抑制细胞表面糖蛋白酶P(glycoprotein P,Pgp)降解药物活性蛋白.纳米粒子(nanoparticles)通过角膜上皮和结膜上皮而不会引起毒性.纳米胶囊(nanocapsules)更深地内化到角膜上皮(50μm处).聚合物胶束(polymeric micelles)自组装成核-壳纳米载体增强药物渗透角膜的能力.阴离子高代聚酰氨基胺(poly-amidoamine,PAMAM)树枝状大分子增强药物通透性,中性和阳离子低代树枝状大分子通过网格蛋白途径介导药物更高的通透性.纳米晶体(nanocrystal),除增强药物溶解度和溶解速率之外,它的高黏附能力帮助药物保留和渗透到眼组织中.纳米结构材料与干眼关联密切,为干眼的治疗、诊断提供手段.

目的 制备一种以人上皮生长因子受体2(HER2)为靶点同时载有单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因且具有核定位效应的纳米超声造影剂,并探讨其理化特性和体外超声显影效果.方法 采用前期课题组构建的胍基化SS-PAAs类阳离子聚合物AGM-CBA,制备AGM-CBA/HSV-TK载体基因复合物并测定其粒径,采用薄膜水化—机械振荡法制备生物素化脂质体,以桥联亲和素—生物素法制备以HER2为靶点的靶向纳米级脂质微泡超声造影剂.对超声造影剂的外观形态、粒径、电位等进行表征;使用流式细胞仪定量检测HER2抗体与造影剂连接情况;使用多普勒彩色超声仪观察靶向纳米造影剂的超声显影效果.结果 AGM-CBA/HSV-TK载体基因复合物粒径为(96.73±1.27)nm,所制备的纳米微泡超声造影剂呈相对规则圆整的球形,粒径为(550.93±10.19)nm,Zeta电位为(-9.75±0.74)mV.HER2抗体与造影剂成功连接.体外超声成像显示,纳米超声造影剂呈细腻均匀的点状密集高回声.结论 成功制备出HER2靶向载HSV-TK基因并具核定位效应的纳米超声造影剂,且体外超声显影效果理想.

目的 探讨超声联合生物纳米泡在体外介导基因编辑的可行性.方法 提取生物纳米泡(GVNPs),用阳离子聚合物PEI修饰其表面,再与载有向导RNA(sgRNA)的质粒共孵育构建GVNPs-PEI-DNA(GVPD)转染复合物,通过转染sgRNA进入稳定表达Cas9蛋白的细胞系的方式,介导基因编辑.实验分为空白组(Blank组)、单纯GVPD转染组(-US组)和超声联合GVPD转染组(+US组).流式细胞仪评估转染效率,CCK-8检测细胞增殖活性,流式分选结合有限稀释法筛选阳性单克隆,T7EI酶切和Sanger测序法进行鉴定.结果 超声联合GVPD组的转染效率较其他组显著增加,递送后各组细胞活力未发现显著改变,阳性单克隆的T7EI酶切和测序结果都显示出有效的基因编辑.结论 超声联合生物纳米泡可以介导基因编辑,为CRISPR/Cas9系统提供了一种新的非病毒载体递送方式.