中国已从自然界采集的蚊虫标本中分离出多株正布尼亚病毒，包括Simbu血清群的Cat Que、曼扎尼拉和阿卡斑病毒，以及加利福尼亚血清群的Tahyna病毒。但自20世纪80年代以来，还未从蚊虫以外的吸血节肢动物中分离出正布尼亚属的病毒。在本研究中，JXLC1806-2病毒于2018年夏天从中国东部江西省黎川县采集的库蠓中分离，该病毒分离物在接种哺乳动物细胞(BHK-21)48小时内显示出显著的细胞病变作用，病毒滴度为1×10 5.6 pfu/mL。JXLC1806-2病毒不仅在哺乳动物细胞中引起CPE，而且在乳鼠中也可引起发病和死亡，但在C6/36细胞中不引起CPE，并且RT-PCR未检测到复制，提示该病毒为动物病毒。核苷酸和氨基酸序列分析表明，JXLC1806-2病毒基因组由S、M和L三个片段组成。系统发育分析表明，JXLC1806-2病毒的S、M和L基因属于正布尼亚病毒属Tete病毒组，但与Tete血清组的其他成员形成了独立的进化支。结果表明，JXLC1806-2病毒为Tete病毒组的一个新成员，命名为Lichuan病毒，这是中国首次分离到Tete病毒组病毒，也是首次从蚊虫标本之外的蠓虫标本中分离到正布尼亚病毒属病毒。由于该病毒是从养牛场的库蠓中分离，加强该病毒在当地牛群中的监测和检测，以及该病毒是否会在当地其他动物中引起感染和疾病的调查具有十分重要的公共卫生意义。

目的:了解云南省家畜阿卡斑病毒(akabane virus, AKAV)的流行情况。方法:2015年4月在云南省芒市设立5只山羊和10头黄牛作为哨兵动物进行家畜虫媒病毒监测，5～10月份每周采集动物血液，标本经实验室处理后接种BHK-21细胞进行病毒分离，对病毒分离物进行病毒基因(RT-PCR)扩增、核苷酸序测定及分析。结果:1只哨兵山羊血液样品接种BHK-21细胞48 h后产生明显细胞病变，取细胞培养物上清液脑内接种1日龄乳鼠，3 d后乳鼠开始发病死亡，经RT-PCR鉴定和S片段基因序列测定分析，分离毒株为AKAV(毒株编号16415)。16415毒株S片段基因全长856nt，编码N蛋白233aa和Ns蛋白91aa，遗传进化分析结果显示新分离16415毒株与国内外分离的AKAV位于同一进化分支内，核苷酸同源性在83.8%～97.7%之间；进一步分析发现16415株与广西2013年从竹鼠脑内分离到的AKAV亲缘关系最近，核苷酸和氨基酸同源性分别为97.7%、99.6%；与日本AKAV OBE-1毒株相比，16415株、广西竹鼠分离毒株和德宏迷糊按蚊分离毒株在N蛋白上存在2个共同的差异位点，分别是N115位和N206位。结论:在云南省芒市地区设置的哨兵山羊血液标本分离到AKAV，具有重要的流行病学意义。

目的 了解四川省的蚊、蠓以及相关虫媒病毒种类及分布.方法 在自然界使用灯诱法采集吸血昆虫标本,形态学分类后分装,液氮保存备用.蚊虫、蠓虫研磨上清液接种BHK-21细胞和C6/36细胞进行病毒分离和病毒基因检测.使用BioEdit 7.0.5.3、MEGA 6.0等软件对病毒序列进行分子生物学特征分析.结果 2016-2017年在四川省东南部3个县的7个自然村共采集到3属4种蚊虫17 019只,蠓虫12 700只.三带喙库蚊占蚊虫采集总数的79.4％(13 519/17 019),其次为骚扰阿蚊(11.1％,1 897/17 019),致倦库蚊占采集蚊虫标本总数的5.5％(930/17 019);中华按蚊最少(4.0％,673/17 019).蚊虫标本接种组织细胞后,在合江县采集的三带喙库蚊标本获得3株可以稳定传代的病毒分离株,经分子生物学实验鉴定为基因Ⅰ型流行性乙型脑炎(乙脑)病毒,在合江县采集的7批蚊虫中检测到乙脑病毒基因阳性.蠓虫标本接种细胞后未获得病毒分离物,在合江县采集的4批蠓虫标本经分子生物学检测,显示阿卡斑病毒基因阳性.结论 三带喙库蚊是四川省东南部3县的优势蚊种,四川省东南部存在经蚊虫传播的乙脑病毒及以蠓虫为媒介的阿卡斑病毒.

目的 了解海南省虫媒病毒种类及分布变化.方法 于2017-2018年在海南省野外采集吸血昆虫标本,所有吸血昆虫标本实验室处理后用BHK-21细胞和C6/36细胞进行病毒分离,同时使用RT-PCR平行检测吸血昆虫标本中虫媒病毒基因.结果 共采集到4属(库蚊、阿蚊、伊蚊、按蚊)15 062只蚊虫和11 360只蠓虫.采集的蚊虫中三带喙库蚊居多,占蚊虫采集总数92.88％(13 990/15 062).经组织培养细胞共获得4株病毒分离物,其中3株乙型脑炎(乙脑)病毒、1株盖塔病毒,在5批三带喙库蚊标本中检测到乙脑病毒基因阳性.遗传进化分析结果显示这3株乙脑病毒和5批PCR筛检阳性的标本均属于基因1型乙脑病毒.当地乙脑病毒的最低感染率为0.57‰(8/13 990).在5批蠓虫标本中检测阿卡斑病毒基因阳性,当地阿卡斑病毒的最低感染率为0.44‰(5/11 360).基于病毒S基因和M基因序列的系统进化分析显示这5株阿卡斑病毒处于单独进化分支形成独特的地理分布特征.结论 继1980年代以来,从海南省的蚊虫标本中再次分离到乙脑病毒和盖塔病毒、蠓虫标本中检测到阿卡斑病毒.应加强乙脑病毒、盖塔病毒和阿卡斑病毒对人畜动物感染状况及疾病负担的监测,以减少对当地公共卫生健康的危害.

帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)具有多种血清型,可引起感染的妊娠家畜出现生产异常,在我国呈广泛流行的趋势,但目前尚无该病毒的高通量快速检测技术.本研究旨在建立PALV的高通量逆转录实时荧光定量(Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测方法用于临床样本中病毒的检测.采用一步法RT-PCR对我国流行的PALV代表毒株的基因节段7(Seg-7)进行全长序列测定,根据Seg-7高度保守的区域合成特异性PCR引物与TaqMan探针,建立PALV的qRT-PCR检测方法;以体外转录PALV的Seg-7 ssRNA为模板,分析qRT-PCR检测方法的特异性、敏感性与重复性;以我国不同血清型的PALV分离毒株及血液样本为检测对象,分析qRT-PCR检测方法的实际检测效果.测序结果显示我国流行的不同血清型PALV毒株Seg-7序列高度保守,且与日本毒株的核酸序列相似度为99.59％～99.80％.建立的PALV群特异性qRT-PCR检测方法具有良好的灵敏度、特异性与准确性:可检测PALV最低核酸拷贝数为23拷贝,与蓝舌病病毒、流行性出血病病毒、非洲马瘟病毒、西藏环状病毒、云南环状病毒、广西环状病毒、牛流行热病毒以及阿卡斑病毒之间无交叉反应;对我国不同血清型的PALV分离毒株及分离病毒的血液样本的检测结果吻合率达到100％.对120份临床血液样本进行PALV核酸与抗体检测结果显示:qRT-PCR检测阳性率为35％,而抗体C-ELISA检测阳性率为30％,二者吻合率为85.7％.本研究提示PALV的Seg-7序列高度保守,可作为病毒核酸检测的靶基因.本研究所建立的PALV群特异性qRT-PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、可靠性好的优势,为开展PALV诊断与流行病学监测提供了新的技术手段.

阿卡斑病毒(Akabane virus,AKV)和Oya病毒(Oya virus,OYAV)均属于泛布尼亚病毒科、正布尼亚病毒属的两种病毒,可引起动物疾病,目前广东省尚不清楚是否存在这两种病毒.为了解这两种病毒在广东省的存在状况及分子特征,2018年4月至7月,分别在广东省的佛山、信宜、河源和阳江四个地市利用人诱法和诱蚊灯法采集吸血昆虫标本.采集的标本分类后,按20～ 50只/批,蠓虫按200～500只/批分装,液氮保存运输.标本破碎离心后,上清用于接种细胞和病毒核酸提取.Real-time RT-PCR检测AKV和OYAV阳性的样本用于S基因的扩增、测序和系统进化分析.本次研究共采集各类吸血昆虫421批次,Real-time RT-PCR检测AKV阳性10份,均来自蠓虫标本,RT-PCR检测AKV阳性5份,其中4份成功测序;Real-time RT-PCR检测OYAV阳性15份,其中蠓虫13份、中华按蚊和三带喙库蚊各1份,RT-PCR检测OYAV阳性6份,其中4份成功测序.病毒分离结果均为阴性.进化分析结果显示,所有序列共分为5个血清群,本次研究的8条序列均位于Simbu群,其中4个新毒株与OYAV代表株NIV86209的核苷酸同源性最高可达96.87％,氨基酸同源性最高为100％;另外4株新病毒与AKV代表株GXLCH02的核苷酸同源性最高达98.60％,氨基酸同源性最高为99.57％.本研究结果揭示,AKV和OYAV在广东省的虫媒中分布广泛,主要以蠓虫分布为主,来自蠓虫中的新OYAV和AKV与其它媒介或宿主中的AKV和OYAV高度同源,未显示明显媒介差异的分子特征.

流行性出血病病毒(EHDV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒,目前世界范围已发现9种血清型的EHDV,本研究旨在建立EHDV的血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)诊断技术.以决定EHDV血清型的基因节段2(Seg-2)作为靶基因,设计8对特异性扩增引物和TaqMan探针,以不同血清型EHDV代表毒株的cDNA为模板,分析检测方法特异性、敏感性;以不同血清型的EHDV分离毒株及临床血液样本为检测对象,分析该方法的实际检测效果.实验结果显示:建立的EHDV血清型特异性qRT-PCR检测方法具有高度的特异性和灵敏性,可准确鉴定不同血清型EHDV,与蓝舌病病毒、中山病病毒和阿卡斑病毒之间均无交叉反应;qRT-PCR反应的扩增效率均达到90％以上,对不同血清型EHDV核酸检测灵敏度在24拷贝/μL～44拷贝/μL之间.对我国分离的31株EHDV进行血清型qRT-PCR鉴定,结果显示分离的EHDV分别为EHDV-1(6株)、EHDV-5(9株)、EHDV-6(11株)、EHDV-7(2株)与EHDV-10(3株).对不同血清型EHDV感染动物的血液样本检测结果显示,本方法能在动物感染EHDV早期鉴定出病毒的血清型,与血液样本中分离EHDV毒株的血清型鉴定结果一致.本研究建立的EHDV血清型荧光定量RT-PCR定型方法具特异性强、灵敏度高和耗时少等优点,可用于动物感染EHDV血清型的快速与准确诊断,具有良好的应用与推广价值.

阿卡斑病毒(Akabane virus,AKV)是能引起牛、绵羊、山羊流产、早产、新生胎儿畸形的虫媒性RNA病毒.为了解家畜虫媒病毒在我国西南边境地区的分布和流行情况,本研究对中缅边境西盟县的52份牛抗凝血和140份血清(牛70份、羊70份)中的蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、鹿流行性出血热病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)、AKV等虫媒病毒进行检测与分离,通过ELISA及qRT-PCR方法检测病毒,通过核酸阳性抗凝血接种BHK细胞传代以分离病毒,通过设计特异性引物,扩增分离毒株S基因721bp片段及M基因816bp片段,通过克隆测序及中和试验以鉴定病毒,最终从38号牛的抗凝血中分离到一株AKV,TCID50为10-35/0.1mL,经比对,分离株S片段与日本KS-2/Mo/06毒株亲缘关系最近,核苷酸同源性为97.66％,M片段与中国DHL10M110毒株亲缘关系最近,核苷酸同源性为96.56％.本研究首次报告了从云南边境地区牛群中分离到AKV,证实了西南边境存在AKV的流行,为AKV在我国的流行病学和边境地区疫病风险防控提供了重要参考及有力依据.

为建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)十二种血清型(血清6、8、10、11、13、14、17、18、19、20、22与23型)特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测方法,根据GenBank公布的十二种BTV血清型毒株的基因节段2序列,选择高度保守区域,设计每种BTV血清型的扩增引物与TaqMan探针;以十二种血清型BTV参考毒株的cDNA为模板,进行引物的筛选,建立BTV血清型特异性qRT-PCR检测方法;对检测方法的灵敏度、特异性与重复性进行验证,分别以含有50、100与200个BTV噬斑形成单位(Plaque forming unit,PFU)的模拟BTV阳性血液样本为检测对象,进行检测效果的评估.实验结果表明,建立的BTV血清型特异性qRT-PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异性,对不同血清型BTV核酸拷贝数的检出下限在12拷贝/μL(BTV-8)至57拷贝/μL(BTV-14)之间;对我国反刍动物上广泛流行的流行性出血病病毒、中山病病毒与阿卡斑病毒核酸的检测结果均为阴性.反应具有良好的重复性,组内Ct值的变异系数在0.92％至1.96％之间,组间Ct值的变异系数在0.26％至1.62％之间.对模拟BTV阳性血液样本的检测结果显示,BTV血清型特异性qRT-PCR可有效检测含50个PFU(噬斑形成单位)的BTV血液样本.本研究建立的十二种BTV血清型特异性qRT-PCR定型方法具有特异性强、灵敏度高和耗时少等优点,可用于动物感染BTV血清型的诊断.

云南省为南亚热带气候,适于各类吸血节肢动物的生存繁殖及某些虫媒病毒的保存和传播.迄今,云南已分离到至少8科10属28种虫媒病毒,其中包括能引起人和/或家畜严重疾病的流行性乙型脑炎、登革、基孔肯雅、蜱媒脑炎、寨卡、辛德毕斯、巴泰、马亚罗、肯科伊、盖塔、蓝舌、坦布苏、阿卡斑和曼扎尼拉等病毒;还发现可能导致人、畜感染的新病毒如版纳病毒、云南环状病毒、芒市病毒,以及昆虫特异性病毒如浓核病毒、库蚊黄病毒、伊蚊黄病毒、伊蚊弹状病毒等,为国内已发现虫媒病毒种类最多的省份.加强虫媒病毒和虫媒病毒病调查研究及防控仍是云南省当前面临的重要任务.本文对近20年(2001-2020年)云南省虫媒病毒及其相关疾病研究进展及公共卫生意义做一综述.