目的:了解内蒙古自治区的吸血昆虫及其携带虫媒病毒的种类及分布，为虫媒病毒病的预防提供基础数据。方法:在自然界使用灯诱法采集蚊虫标本，形态学分类后分装编号，液氮保存。组织培养法进行病毒分离。使用多种生物学信息软件（BioEdit、MEGA等）对病毒核苷酸序列进行分子生物学特征分析。结果:2014、2017-2018年在内蒙古自治区5个县（旗）的采集点共采集到2属3种蚊虫24 240只，蠓虫17 110只。其中在淡色库蚊标本中检测到乙脑病毒基因阳性，并且获得4株可以稳定传代的病毒分离物，经分子生物学鉴定分别为盖塔病毒、浓核病毒。盖塔病毒（NMDK1813-1）E2基因遗传进化分析结果显示，与甘肃分离株（GS10-2）在同一进化分支，且有6个共同的氨基酸变异位点。结论:本研究发现的乙脑病毒和盖塔病毒均是在内蒙古蚊虫标本中新近发现的病毒，这为内蒙古地区的虫媒病毒及其传播疾病的预防及控制提供了基础数据，对内蒙古的虫媒病毒及其病毒病的预防及控制提出了新的挑战。

目的:建立一种灵敏且特异的实时荧光定量RT-PCR方法，用于快速检测盖塔病毒(getah virus, GETV)。方法:从GenBank数据库下载GETV基因序列，使用Clustal X完成序列比对，针对高保守区段设计特异性引物和探针；以GETV核酸为标准品建立标准曲线，分别对检测反应的灵敏度、特异性和稳定性进行评价。结果:本方法能特异地检测GETV，与多种虫媒病毒无交叉反应；灵敏度为1.0×10 pfu/ml，批内和批间变异系数均小于1%。从湖南、河北、福建、重庆采集的196批蚊虫中检出1批GETV阳性。结论:建立了灵敏度高，特异性强的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法用于GETV筛查。

目的 研制检测基孔肯雅热免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)抗体的酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)快检试剂盒,为流行病学调查及实验室诊断提供新的工具.方法 以基孔肯雅病毒特异性原核表达抗原pMal-chik23为诊断抗原,以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记抗IgG二抗为显色抗体,正交实验对诊断抗原、待检血清、二抗工作浓度进行优化,并对包被、封闭、孵育及显色等反应条件进行系统优化,在临床大样品评估的基础上,确定ELISA检测的临界值.在此基础上,对ELISA反应的特异性、灵敏性及稳定性进行评估,研制组装检测基孔肯雅热IgG抗体的ELISA快检试剂盒.结果 经系统优化,研制、组装了检测基孔肯雅热IgG抗体的间接ELISA快检试剂盒,其最佳反应条件为:1.0 μg/mL包被抗原经碳酸盐缓冲液4 ℃包被24h,HBV封闭液37℃封闭4 h,待检样品1:101稀释后,100μL/孔,37℃反应40 min,磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffered saline with tween 20,PBST)洗涤4次,HRP标记兔抗人IgG 1∶20 000、HRP标记羊抗鼠IgG 1∶10 000稀释后,100 μL/孔,37℃反应30 min,PBST洗涤5次,TMB显色液 100 μL,37 ℃显色 10 min,50 μL 20％H2SO4终止反应,双波长450/630 nm测定 A450 nm值.试剂盒性能评估结果表明,所研制试剂盒与所试阳性样品检测A450 nm值＞0.43,阴性样品检测A450nm值＜0.04,S/N比值＞10,与辛德毕斯、盖塔、罗斯河、登革等9种其他相近虫媒病毒均无交叉反应,并具较高稳定性,板内变异系数为0.76％～2.12％,板间变异系数为0.64％～1.85％,批间变异系数为0.83％～2.31％,均小于3％,4℃保存1年性能无明显下降.结论 研制了检测基孔肯雅热IgG抗体的间接ELISA快检试剂盒,具备良好的灵敏性、特异性与稳定性.

盖他病毒(Getah virus,GETV)是一种广泛分布于欧亚大陆及澳大利亚北部太平洋沿岸的人兽共患虫媒病毒,我国目前各地仅从蚊子中分离到该病毒.本研究在对一猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)流产胎儿进行多重RT-PCR检测时,由检测猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的一对引物扩增出一非特异性条带,测序及在NCBI数据库中BLAST结果显示,该序列与GETV序列高度相似.经病毒分离、传代、蚀斑纯化,获得一株能够在Marc-145细胞上稳定生长的分离物.电镜观察显示,该病毒有囊膜及纤突,直径约70 nm,接近于球形,具有披膜病毒科甲病毒属成员的典型形态特征,将该分离物命名为HNJZ-S1株盖塔病毒(Getah virus).全基因序列分析结果显示,分离物HNJZ-S1基因组全长11 689 bp,与GenBank中现有14株GETV序列相似性为97.4％～99.3％,其与韩国猪源毒株AY702913(登录号AY702913)序列相似性最高(99.3％).遗传进化分析显示,HNJZ-S1与日本蚊源毒株12IH26、马源毒株14-I-605-C1、14-I-605-C2及中国蚊源毒株HB0234亲缘关系最近,处于同一进化分支.其E2基因推导的氨基酸序列分析结果显示,HNJZ-S1与韩国猪源毒株AY702913和QIAG9302以及日本马源毒株14-I-605-C1、14-I-605-C2和中国蚊源毒株HB0234等处于同一进化分支.本研究首次从我国发病猪群中检测并分离到GETV,也是迄今为止中国唯一一株来自脊椎动物的盖他病毒,对猪源GETV的感染谱和致病性、感染和传播机制、环境微生物学及公共卫生等相关研究具有重要意义,并为之提供了宝贵的研究素材.

目的 了解贵州省东北部地区蚊虫以及蚊传虫媒病毒的种类及其分布.方法 2017年在贵州省德江、江口县村庄的动物饲养圈使用诱蚊灯采集蚊虫,现场分类并冻存于液氮备用.采集的蚊虫标本在实验室处理后接种BHK-21和C6/36细胞分离病毒,同时进行标本中病毒基因检测.使用生物信息学软件对病毒基因组开展分子遗传学分析.结果 2017年在贵州省德江县龙泉乡居池坝村、青龙镇石打头村、江口县快场村共采集蚊虫3属3种7 380只,其中骚扰阿蚊最多,占采集蚊虫总数的61.55％(4 542/7 380),中华按蚊占26.80％(1 978/7 380),三带喙库蚊810只以及其他蚊虫50只.从蚊虫中分离到3株引起组织培养细胞病变的病毒分离物;经分子生物学鉴定,从三带喙库蚊中分离的病毒株GZDJ1765属于Ⅰ型流行性乙型脑炎(乙脑)病毒,另2株病毒株均来自骚扰阿蚊(GZDJ 1746-1、GZDJ 1752-1),经鉴定为盖塔病毒.3批蚊虫(GZDJ1704、GZDJ 1743-2、GZDJ 1751-2)乙脑病毒基因PCR检测均为阳性.结论 贵州省东北部地区所调查的农村地区动物饲养圈骚扰阿蚊为优势蚊种,蚊虫中携带乙脑病毒和盖塔病毒.

目的 对检测到的疑似盖塔病毒进行分离鉴定和全基因序列遗传进化分析.方法 从四川某猪场1例混合感染猪繁殖与呼吸综合征的仔猪血液中,进行RT-RCR检测,检测到GETV阳性.对样品进行无菌处理后,接种至BHK21细胞,连续传代培养,通过细胞病变、蚀斑纯化、RT-RCR扩增和全基因序列测定鉴定细胞培养物.结果 我们成功分离到四川首株猪盖塔病毒,并将其命名为SC201807;对该病毒全基因扩增测序并进行序列分析,发现SC201807与GenBank中上传的35株GETV序列相似性为99.0％～96.1％,E2序列高度保守仅在E310(天冬氨酸→谷氨酸)发生突变.全基因组核苷酸以及E2氨基酸序列遗传进化分析显示SC201807株与中国猪源HNJZ-S2及日本蚊源15-I-752、15-I-1105、14-I-605-C2、14-I-605-C1、12IH26亲缘关系最近,处于同一进化分支.结论 SC201807株扩充了猪源GETV的感染谱,对其致病性、感染和传播机制、环境微生物学及公共卫生等相关研究提供素材.

目的 了解海南省虫媒病毒种类及分布变化.方法 于2017-2018年在海南省野外采集吸血昆虫标本,所有吸血昆虫标本实验室处理后用BHK-21细胞和C6/36细胞进行病毒分离,同时使用RT-PCR平行检测吸血昆虫标本中虫媒病毒基因.结果 共采集到4属(库蚊、阿蚊、伊蚊、按蚊)15 062只蚊虫和11 360只蠓虫.采集的蚊虫中三带喙库蚊居多,占蚊虫采集总数92.88％(13 990/15 062).经组织培养细胞共获得4株病毒分离物,其中3株乙型脑炎(乙脑)病毒、1株盖塔病毒,在5批三带喙库蚊标本中检测到乙脑病毒基因阳性.遗传进化分析结果显示这3株乙脑病毒和5批PCR筛检阳性的标本均属于基因1型乙脑病毒.当地乙脑病毒的最低感染率为0.57‰(8/13 990).在5批蠓虫标本中检测阿卡斑病毒基因阳性,当地阿卡斑病毒的最低感染率为0.44‰(5/11 360).基于病毒S基因和M基因序列的系统进化分析显示这5株阿卡斑病毒处于单独进化分支形成独特的地理分布特征.结论 继1980年代以来,从海南省的蚊虫标本中再次分离到乙脑病毒和盖塔病毒、蠓虫标本中检测到阿卡斑病毒.应加强乙脑病毒、盖塔病毒和阿卡斑病毒对人畜动物感染状况及疾病负担的监测,以减少对当地公共卫生健康的危害.

盖塔病毒(GETV)是一种经蚊虫传播的虫媒病毒,可引起猪、马等家畜疾病,也可导致人类感染.目前,我国已从至少15个省(直辖市、自治区)的蚊虫、蠓、猪和狐狸中共分离到约70株GETV,三带喙库蚊和骚扰阿蚊是主要传播媒介.最近研究表明,GETV可分为4个进化种群(Group Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ),其中Group Ⅰ和Ⅱ分别为马来西亚(1955年)和日本(1956年)早期流行株;Group Ⅲ几乎包括1960年以来我国及其他国家所有分离株;Group Ⅳ于近期在我国云南省和俄罗斯远东地区被发现.空间动力学研究认为,马来西亚、日本和中国云南省是3个主要的GETV播散来源,而云南省是GETV迁徙事件发起的重要地区及中国内陆省份GETV循环的源泉地区.近几年调查还证实,我国湖南、河南、四川等省猪场猪群以及山东省饲养场狐狸中存在盖塔病毒病的流行,并从流行区猪、牛等家畜以及发热病人和健康人血清中检测到该病毒特异性抗体,表明GETV在我国流行广泛,是当前我国需要关注的重要公共卫生问题.

目的 了解我国西南边境地区蚊类种群构成及携带病原体情况,为蚊媒传染病防控工作提供技术支撑.方法 2017年8月8-18日,采用灯诱法、BDV帐诱法及人工小时法在中缅边境地区(瑞丽)、中越边境地区(河口、凭祥、东兴)开展蚊类监测;用RT-PCR法对采集的蚊类进行病原体检测.结果 2017年8月,在中缅、中越边境地区采集到蚊类5属6种25 306只,从57批蚊类样本中检测到乙脑病毒、盖塔病毒、广平病毒、坦布苏病毒.结论 我国西南边境地区蚊类虫媒病毒携带率较高,应加强系统性监测,预防蚊媒传染病跨境传播.

目的 采用PCR检测方法对新疆北疆口岸媒介生物蚊虫携带病毒情况开展调查.方法 2018年7-10月在北疆7个口岸进行蚊虫采集,采用特异性引物行RT-PCR、多重实时荧光定量PCR检测西尼罗、寨卡、登革热、基孔肯尼雅热、辽宁病毒、盖塔病毒和布尼亚病毒.结果 共采集蚊虫6440只,经分类鉴定分为4属8种,将6440只蚊虫(分成214组,每组 30只)进行携带西尼罗病毒、寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯尼雅热病毒、辽宁病毒、盖塔病毒、布尼亚病毒检测,所有蚊虫的病毒基因检测结果皆为阴性.结论 本次调查选择的生境采集的蚊虫均未携带西尼罗病毒、登革热病毒、寨卡病毒、基孔肯尼雅热病毒、辽宁病毒、盖塔病毒和布尼亚病毒.