[目的]解析夏冬季节发酵的雪茄烟叶代谢物差异.[方法]采用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)技术对发酵前、冬季发酵、夏季发酵的雪茄烟叶样品进行广泛靶向代谢物检测.[结果]发酵期间(历时 34 d)夏季、冬季发酵房平均温度分别是 27.2℃、14.7℃,二者相差 12.5℃,平均湿度分别是 77.6%、66.7%,二者相差 10.9%,夏季更符合烟叶发酵相对高温、高湿的环境要求;雪茄烟叶样品检测得到 905 种代谢物包含 10 类:生物碱、酚酸、黄酮、脂质、氨基酸、有机酸、萜类、糖类、核苷酸、木质素,其中生物碱、有机酸、脂质含量比例居前三,分别是 24.5%、23.7%、15.0%.烟叶发酵后,有机酸、脂质、氨基酸、酚酸的含量都显著提升,生物碱、萜类、黄酮、糖类、木质素的含量有不同程度的减少.夏季发酵的烟叶生物碱、萜类代谢转化更剧烈,有机酸、氨基酸、黄酮、脂质、糖类含量较高,化学成分更协调,香气质量更丰富,烟气柔顺、余味甜润,感官品质更优.[结论]鄂西南地区夏季自然高温高湿环境,更顺应雪茄烟农业发酵理想状态,将当年生产的雪茄烟叶在冬季自然醇化后推迟到次年夏季发酵,或可作为探索推动雪茄烟发酵工序提质增效的参考方案.

[背景]烟草特有亚硝胺(tobacco-specific nitrosamines,TSNAs)是烟草于调制和发酵阶段产生的一类致癌物质,由烟草生物碱与氮氧化物发生亚硝化反应生成,生物碱和亚硝酸盐是TSNAs的直接前体物质.[目的]发掘适用雪茄高温发酵且显著降低 TSNAs形成与积累的微生物.[方法]以 TSNAs前体物质亚硝酸盐的高效降解为目标,对从雪茄烟叶分离得到的烟草源微生物菌株进行高温培养、亚硝酸盐降解及亚硝酸盐耐受能力研究,得到可于 50℃高效降解亚硝酸盐及耐受高浓度亚硝酸盐的微生物菌株,将菌株应用于雪茄烟叶高温发酵 35 d,对发酵前后亚硝酸盐、TSNAs、常规化学成分和中性香味成分含量进行测定,分析菌株在雪茄烟叶发酵中对TSNAs含量及烟叶品质的影响.[结果]获得了 3 株于 50℃高效降解亚硝酸盐的菌株NY7、NY8 和NY9,分别鉴定为莫海威芽孢杆菌(Bacillus moj avensis)NY7、耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)NY8 和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NY9,其中B.halotolerans NY8 亚硝酸盐降解能力最为显著.添加了菌株NY8 的雪茄烟叶发酵过程中亚硝酸盐和TSNAs含量均显著降低,亚硝酸盐含量减少 96.86%,TSNAs总量减少 67.14%,烟碱的下降幅度明显高于空白组.中性香味成分总量(除新植二烯外)略有升高.[结论]该菌株适用于雪茄烟叶高温发酵,并高效降解亚硝酸盐,有效减少 TSNAs 的形成和积累,对雪茄烟叶减害具有重要的科学价值和应用潜力.

通过筛选可降解类胡萝卜素的烟草内生菌,并应用于国产雪茄烟叶发酵从而实现烟叶香韵和感官质量提升.首先,原位培养基中添加烟叶粉末模拟原位生长环境以富集烟叶内生菌,结合流式分选技术,从优质雪茄烟叶内生菌中筛选具有β-胡萝卜素降解能力的菌株;将菌株接种至国产雪茄烟叶发酵,检测发酵烟叶类胡萝卜素降解产物含量并进行感官评价.结果显示,共筛选获得 21 株内生菌对β-胡萝卜素的降解率超过 50%,主要为农杆菌属、根瘤菌属、鞘氨醇杆菌属、肠杆菌属等.菌株C31、C11、H4 能够增加烟叶香韵类型,明显改善烟叶香气质、香气量、杂气、刺激性等指标,发酵烟叶类胡萝卜素降解产物含量分别是对照的 1.38、1.28、1.43 倍,其中法尼基丙酮、香叶基丙酮、巨豆三烯酮的增加强化了烟叶焦甜香、花香、木香香韵.综上,原位筛选获得的 3 株类胡萝卜素降解内生菌C31、C11、H4 能够较好地改善国产雪茄烟叶品质,可作为新型雪茄工业微生物制剂和特征香韵雪茄微生物制剂进一步开发应用.

细菌在烟叶发酵过程中起着重要作用, 为探索烟叶的发酵机理, 采用Illumina miseq高通量测序技术 (Highthroughput sequencing, HTS) 和传统微生物分离方法, 对墨西哥不同发酵时期雪茄外包皮表面细菌群落结构、丰富度及演替进行研究. (1) HTS获得有效序列条数514 641条, 包含65个OTUs, 主要种属为棒状杆菌属 (Corynebacterium) 、葡萄球菌属 (Staphylococcus) 、不动杆菌属 (Acinetobacter) 、假单胞菌属 (Pseudomonas) 、芽孢杆菌属 (Bacillus) 等.HTS结果表明, 墨西哥雪茄外包皮表面细菌群落组成丰富, 细菌群落结构随发酵进程而变化, 优势微生物由棒状杆菌属 (44.64％) 和假单胞菌属 (40.88％) 演替为后期的葡萄球菌属 (72.78％).α多样性结果表明FJQY-1和FJQY-2样品的细菌群落具有较高的丰富度.β多样性分析发现FJQY-2、FJQY-3和FJQY-4三个样品细菌结构及丰度较为相似. (2) 传统分离结果显示, 不同发酵时期雪茄外包皮表面细菌主要为芽孢杆菌属 (55.10％) 和葡萄球菌属 (22.45％), 与HTS结果比较, 单一传统分离方法不能全面反映不同时期雪茄外包皮表面细菌群落结构和演替.本研究表明, 在不同发酵时期, 雪茄外包皮表面细菌发生着群落演替;HTS测序在揭示微生物群落演替中发挥了重要作用;传统微生物分离鉴定方法不能全面反映微生物多样性及群落演替, 但能获得发酵过程中的部分微生物用于后期功能研究.

雪茄烟叶中的半纤维素在叶脉及叶片韧性等特性中发挥重要作用,烟叶叶脉较粗,半纤维素含量过高,导致雪茄烟叶韧性较差,可用性变差.本实验室前期筛选到一株产木聚糖酶的蜡样芽孢杆菌,该菌株对烟碱有较好的耐受性,利用液态发酵方法研究菌株以雪茄烟叶为营养源产木聚糖酶的最佳发酵条件,并对最佳发酵条件下菌株降解烟叶中半纤维素的效果进行测定,最后分析比较了菌株对雪茄烟叶香气物质成分及含量的影响.结果表明,菌株在含有不高于1.0 g/L烟碱的培养基中生长受抑制较小,菌株对烟碱有良好的耐受性;当培养基中初始pH 6.7,接种量为5％,雪茄烟叶底物浓度为20 g/L,发酵24 h,菌株产木聚糖酶活性最高,可达(4.04±0.18)U/mL;在最佳发酵条件下,雪茄烟叶中半纤维素含量为3.38％,降低了6.63％,纤维素含量为10.54％,降低了8.19％,利用菌株发酵同时降低了雪茄烟叶中纤维素和半纤维素含量;通过对香气物质影响的分析比较,发现经菌株发酵后的雪茄烟叶能够提升叶绿醇(2.85％)、油酸(0.62％)、正二十六烷(1.75％)和正三十一烷(14.47％)等物质的含量.蜡样芽孢杆菌B.cereus对雪茄烟叶中半纤维素及纤维素降解具有一定作用,后期可应用于雪茄外包皮烟叶的固态发酵,进一步改善雪茄外包皮烟叶的物理特性,为该菌株的开发利用奠定基础.