[目的]旨在探究不同来源碳水化合物结合域(CBM)对山毛榉木聚糖的结合能力,并将具有较高结合能力的外源CBM融合到链霉菌L10904 木聚糖酶(XYN)的C端和N端,以探究外源CBM对木聚糖酶酶学性质的影响.[方法]通过底物吸附方法,利用考马斯亮蓝G250 法检测溶液中CBM在吸附前后的浓度,计算CBM的底物结合率,筛选到了结合木聚糖能力较好的CBM1 和CBM4.为了探究对底物结合能力高的CBM融合位置对木聚糖酶酶学性质的影响,将CBM1 和CBM4 通过柔性连接肽分别与XYN的C端和N端融合,并在大肠杆菌中表达获得 4 种重组酶,分别命名为CBM1-XYN、XYN-CBM1、CBM4-XYN和XYN-CBM4.[结果]CBM1 和CBM4 与木聚糖结合率分别为 89%和 95%.在 60℃,pH 7.0 反应条件下,XYN、CBM1-XYN、XYN-CBM1、CBM4-XYN和XYN-CBM4 的比活力分别是 32 274.81、49 342.21、602.48、230.42 和 2 362.24 U/mg,CBM1-XYN比活力较XYN比活力提高了 1.5 倍.酶学性质分析表明,CBM1 使XYN温度稳定性和pH稳定性得到了提高,将XYN和CBM1-XYN分别在 60℃孵育 1 h,CBM1-XYN残余酶活力和XYN残余酶活力分别为 81%和 28%;在pH 3-11 范围内,CBM1-XYN在 4℃孵育 12 h后能够保持 90%以上的酶活力.[结论]在大肠杆菌中成功异源表达了链霉菌来源的木聚糖酶,筛选到了对底物结合率高的两种CBM1 和CBM4,并通过蛋白质融合技术成功将CBM融合到XYN上,获得酶学性质得到改良的CBM1-XYN,能够提高木聚糖酶的温度稳定性、pH耐受性及比酶活.

[背景]作为降解木聚糖的核心酶种,木聚糖酶可以有效促进木质纤维素的消化水解,在动物养殖领域应用广泛.来源于嗜热细菌贝斯其热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii)的GH10 家族木聚糖酶CbXyn10C最适温度为 85℃,在 80℃条件下具有良好的热稳定性,具有饲料工业应用潜力.[目的]为满足饲料制粒尤其是水产饲料加工过程的工艺要求,进一步提高木聚糖酶CbXyn10C的热稳定性并阐明其耐热机理.[方法]以CbXyn10C晶体结构为基础,采用刚性氨基酸引入、疏水作用网络重排 2 种策略对其热稳定性进行理性设计,获得在 100℃条件下比活提高的单点突变体后,通过有益突变位点叠加策略进一步提升酶的热稳定性,最后采用分子动力学模拟技术分析其热稳定性提高的分子机制.[结果]共获得了 4 个稳定性提高的单点突变体A45P、T69P、F309V和A325P,其中突变体A45P效果最优.随着在A45P基础上另外 3 个突变位点的叠加,酶的热稳定性在不损失酶活的前提下得到了逐步提升.获得的四点突变体A45P/F309V/A325P/T69P的耐热性最好,其最适反应温度和熔解温度Tm值较野生型分别提高了 5℃和 6.8℃.分子动力学模拟技术分析发现 4 个位点的突变引入了新的氢键作用力且优化了疏水作用网络,进而导致酶的结构构象更加稳定.[结论]本研究不仅提高了木聚糖酶在饲料工业中的应用价值,而且对基于酶蛋白结构的稳定性分子改造提供了理论支持.

为探究体外发酵牦牛瘤胃源厌氧真菌 Orpinomyces sp.YF3 在不同碳源诱导下的产酶机制,本研究利用厌氧培养管在 10 mL 基础培养基中分别添加不同碳源复杂度的葡萄糖(glucose,Glu)、滤纸(filter paper,Flp)、微晶纤维素(avicel,Avi)各 8 g/L作为唯一碳源进行体外发酵,检测发酵液中的纤维降解酶活性和挥发性脂肪酸,并利用转录组学探究Orpinomyces sp.YF3的产酶机制.结果表明葡萄糖诱导下的发酵液中羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶、滤纸酶和木聚糖酶的活性,及乙酸的比例显著升高(P＜0.05),丙酸、丁酸、异丁酸的比例显著降低(P＜0.05).进一步分析发现与纤维降解酶相关的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)在Glu组中显著上调.基因本体论(gene ontology,GO)功能富集显示DEGs主要集中在木聚糖酶、纤维素酶、葡萄糖和碳水化合物等的分解代谢过程及相关酶活性,京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析富集到的纤维降解酶相关的差异通路主要是淀粉和蔗糖代谢途径、其他聚糖降解途径.以上结果表明,以葡萄糖为碳源底物的Orpinomyces sp.YF3可增加纤维素降解酶活性,提高乙酸比例,通过调控纤维降解酶基因的表达及相关代谢通路来提高对底物的降解能力,提高能量利用效率.这为Orpinomyces sp.YF3 在实际生产中的应用提供了理论基础.

[背景]木霉是自然界中常见的纤维素和半纤维素降解菌,在农业废弃物降解中具有重要应用潜力.[目的]筛选可在低温环境降解玉米秸秆的木霉菌株.[方法]测定 31 种木霉 111 个菌株在低温下的生长状况、水解纤维素和木聚糖产生的透明圈直径及部分菌株对玉米秸秆的相对降解率(relative degradation rate,RDR);利用DNS法测定不同RDR代表菌株的纤维素滤纸酶(filter paper cellulase,FPase)、羧甲基纤维素酶(carboxymethyl cellulase,CMCase)和木聚糖酶(xylanase)活性,并分析它们在不同发酵阶段的酶活与秸秆降解率的关系.[结果]在 10℃和 5℃培养分别有100 株和 42株供试菌株能够生长,在 15℃均能生长,其中 19个菌株培养 6 d产生的水解纤维素和木聚糖产生的透明圈直径大于 60 mm、培养 10 d对玉米秸秆的RDR为 0.45%-8.09%;菌株 9145、TC425、TC505 和 8987 的FPase、CMCase和xylanase活性随着培养时间呈现动态变化,其中前两者的活性变化趋势基本一致,与 RDR 的关系密切.[结论]钩状木霉、西蒙斯木霉、深绿木霉和深褐木霉菌株在低温条件下对玉米秸秆具有较高的降解能力,将为后续玉米秸秆腐熟剂开发、降解机理研究及秸秆资源化利用提供种质资源.

[背景]开发生物甲烷资源是减轻化石燃料供求紧张的有效措施,而秸秆类原料的预处理及甲烷生产方法需要不断创新,从而进一步满足可持续发展.厌氧真菌与甲烷菌共培养能够通过假根侵入及纤维降解酶双重预处理秸秆并生产甲烷,但目前全世界被报道的骆驼胃肠道来源的厌氧真菌分离培养物仅有 1 株.[目的]从新疆准噶尔双峰驼瘤胃内容物中分离出新型厌氧真菌和甲烷菌共培养物,研究其在降解秸秆并联合生产生物甲烷方面的应用潜力.[方法]采用Hungate滚管纯化技术将从骆驼胃肠道中分离的厌氧真菌和甲烷菌共培养,对其进行形态学及分子学鉴定,随后厌氧发酵 5 种底物(稻秸、芦苇、构树叶、苜蓿秆和草木樨),研究产甲烷量、降解效果及主要代谢产物等方面的特性.[结果]筛选到的共培养物中的厌氧真菌为Oontomyces sp.CR1,甲烷菌为Methanobrevibacter sp.CR1.其在降解稻秸时表现出最高的木聚糖酶酶活力(21.64 IU/mL)及甲烷产量(143.39 mL/g-DM),甲烷生产特性较分离自其他动物宿主的厌氧真菌共培养物更优.[结论]共培养厌氧真菌与甲烷菌菌株CR1 是一种新型高效降解菌株资源,其在利用木质纤维素生物质生产生物甲烷方面具有良好的应用前景.

利用不同比例的枯草芽孢杆菌K-1菌株和植物乳杆菌R-1菌株青贮玉米秸秆制作品质优良的青贮料.设置两菌株的接种比例梯度为:8∶0、6∶2、4∶4、2∶6及0∶8,28℃青贮.分别对青贮第6、9、12、15和18天的青贮料取样,对颜色、气味和质地进行感官评价,并测定其他与青贮料品质相关的参数.由统计分析所测数据可知:当温度为28℃,菌种体积比为1∶1,青贮15d时,可得到颜色亮黄、酸香浓郁、柔软多汁的青贮料.其pH值、可溶性碳水化合物含量分别为3.76和96.75 mg/g;氨态氮含量为1.019 mg/mL,下降了21.35％;酸性洗涤纤维含量为28.60％,下降了11.67％;中性洗涤纤维含量为46.46％,下降了13.87％.青贮效果显著,青贮料品质优良.

蜜环菌能为药用真菌伞形多孔菌菌核(猪苓)的生长提供营养,其自身也是一种重要的食药用真菌.筛选优良的蜜环菌菌株既可用于猪苓的栽培生产,也可为蜜环菌的进一步开发提供参考.本研究将从野生猪苓中分离得到的47株蜜环菌菌株划分形态型,选取12个代表性菌株进行液体培养,研究菌丝体多糖含量,以及发酵液中的羧甲基纤维素酶(CMC酶)、木聚糖酶、漆酶的活性变化.结果显示,蜜环菌菌株M8-3生长较快,生物量累积最高,3种关键酶的活性也较高,为较优质菌株,可用于猪苓的栽培实验;菌株M3和M8-3菌丝体多糖含量较高,可作为蜜环菌开发利用的候选菌株.

[背景]玉米纹枯病逐渐发展为制约我国玉米持续增产的主要病害,有效霉素A与生防菌木霉均对纹枯病菌具有抗性,但二者各有优缺点.[目的]研究有效霉素A与木霉菌协同作用的可行性,提高对玉米纹枯病的防治水平,实现抗生素类化学农药的减量使用,提高生态环境安全性.[方法]测定有效霉素A处理后的棘孢木霉GDSF1009的细胞壁降解酶及防御反应相关酶活性,烟草叶片验证活性氧及过敏性反应.利用转录组及气相色谱-飞行时间质谱联用分析有效霉素A对GDSF1009基因表达差异及生长代谢的影响,并进行叶片及平皿协同抑菌实验.[结果]有效霉素A对棘孢木霉GDSF1009的几丁质酶、纤维素酶及木聚糖酶的活性无影响,有效霉素A未进入到棘孢木霉菌细胞内.在转录组水平,有效霉素A处理木霉24h和48 h后,与对照相比,差异基因所占比例分别为8.932％和6.779％,有效霉素A对GDSF1009相关的糖类及脂类代谢没有显著影响,仅对氨基酸代谢相关的基因有一些影响,这些基因并不会造成氨基酸代谢的大量变化.同时验证了在二者联合使用时,可以显著地提高玉米纹枯病的防治效果.[结论]有效霉素A对棘孢木霉菌的初生代谢系统是比较安全的,二者协同作用的抗病效果显著高于单因子作用.

同源比对黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xynZF-2氨基酸序列,模拟构建木聚糖酶三维结构,确定能够提高酶热稳定性的最佳突变位点.在C-端引入二硫键,突变xynZF-2 205位点的色氨酸和52位点的丙氨酸为半胱氨酸,获取突变基因T205C-A52C,表达于大肠杆菌BL21(DE3).酶学性质比较发现,突变酶XynZF-T205C-A52C的最适温度为50℃,比原酶XynZF-2提高了10℃;50℃保温5 min,突变酶相对酶活性为55.36％,原酶相对酶活性为32.62％;原酶与突变酶最适pH均为5.0,但相同pH下突变酶的相对酶活性较原酶高;突变酶的pH稳定区间由原酶的5.0～9.0扩大为3.0～9.0.因此,定点突变T205C和A52C在C-端引入二硫键能提高黑曲霉木聚糖酶XynZF-2热稳定性及pH稳定性.

木聚糖酶是一种备受关注的糖苷水解酶,能够应用于酿造、饲料、制药、生物能源等多个领域,但是目前大部分木聚糖酶在低于30℃的环境中活力较低.为了获得在较低温度下具有高活力的木聚糖酶,从青霉L1 (Penicilliumsp.L1)中克隆到一条GH11木聚糖酶基因XYN11A,并在毕赤酵母GS115中进行异源表达.经过纯化和酶学性质测定,该酶的最适pH和最适温度分别为3.5-4.0和55℃,能够在酸性和中性缓冲液(pH 1.0-7.0)中以及40℃下保持稳定,同时对所有已测试的金属离子和化合物都有一定的抗性.值得注意的是,该酶具有GH11家族中比较高的比活力6 700 U/mg,另外,该酶在较低温度20-40℃亦可展现出较高的酶活力(24％-58％).经过16h的榉木木聚糖水解实验,该木聚糖酶的水解产物主要是木二糖、木三糖和木四糖,几乎不产生单体木糖.因该酶同时具有产寡糖、较低温度下活力高以及嗜酸性等3种特性,XYN11A在食品和饲料工业中具有巨大的应用潜力.