为明晰青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)对栖息地底质的偏好,研究通过青海湖裸鲤栖息地调查筛选出5种典型栖息地底质类型,在青海湖支流沙柳河刚北干渠搭建配置有5种底质类型的青海湖裸鲤生境模拟池,采用偏好指数量化法,确定了雌雄个体偏好底质类型及偏好强度,分析了影响青海湖裸鲤底质选择的内外因素.结果表明:(1)单尾青海湖裸鲤雌鱼个体沙砾底质访问时间最长(2540s),雄鱼个体中小卵石底质访问时间最长(1960s);(2)青海湖裸鲤雌鱼只偏好沙砾底质(PI=6595.8),雄鱼偏好3种底质类型,其中中小卵石偏好程度最高(PR=10.3);(3)青海湖裸鲤雄鱼在群体底质选择中会跟随雌鱼的选择偏好,沙砾底质访问时间最长(2051s).研究旨在为青海湖裸鲤河道底质改造、"自然"栖息地的营造提供理论依据.

为探究野生和养殖青海湖裸鲤游泳能力差异,以及游泳能力与体征的关系,研究以青海湖裸鲤为研究对象,利用游泳隧道装置,采用流速递增法,对青海湖裸鲤的野生群体和人工养殖1龄、2龄、3龄群体进行临界游泳速度测定.结果显示,野生组的绝对临界游泳速度(76.17±5.42)cm/s与养殖1龄组(74.59±7.75)cm/s、养殖2龄组(77.58±4.16)cm/s相比差异不显著(P>0.05),但显著低于养殖3龄组(85.99±7.70)cm/s(P<0.05),养殖2龄组与养殖3龄组的绝对临界游泳速度没有显著差异(P>0.05).野生组(3.11±0.38)BL/s的相对临界游泳速度显著低于养殖1龄(7.10±0.83)BL/s、2龄(4.86±0.26)BL/s、3龄组(4.78±1.37)BL/s(P<0.05),养殖1龄组的相对临界游泳速度显著高于养殖2龄组和养殖3龄组(P<0.05),养殖2龄组和养殖3龄组的相对临界游泳速度没有明显差异(P>0.05).临界游泳速度与形态学特征的关系表明,绝对临界游泳速度与全长、体长、头长、体高、体厚、尾柄长、尾柄高、体重无显著相关性,相对临界速度与形态学特征存在显著负相关性.研究表明,在相同年龄,养殖青海湖裸鲤与野生群体相比表现出更强的游泳能力.研究结果可为青海湖裸鲤的人工养殖管理和过鱼通道的建设提供科学依据.

研究利用扫描电镜和HE染色技术来观察青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)的肠道显微结构,并通过DNA宏条形码技术,对其食性特点进行分析.研究结果表明,青海湖裸鲤前、中、后肠的组织结构层次清晰且差异明显,从内向外依次由黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层四层组成,因缺乏黏膜肌,光镜下仅有三层膜结构清晰可见,从前肠至后肠肠腔逐渐减小,黏膜皱褶高度显著降低(P＜0.05),宽度显著增加(P＜0.05),杯状细胞、分泌孔及分泌物颗粒的数量也相对减少;18S rDNA和rbcL基因DNA宏条形码测序分析结果显示:青海湖裸鲤肠道内容物测序获得51656个OTU,剔除鱼类自身序列、细菌、古菌及真菌的序列后共39031个OTU注释为43门、114纲、282目和435科.在门水平上主要以链型植物门(53.73％)、硅藻门(23.19％)、p_unclassified_d_Eukaryota(11.14％)、丝足虫门(6.67％)、p_unclassified(1.93％)和轮虫动物门(0.67％)为主,纲水平上,主要以真藓纲(35.79％)、硅藻纲(23.05％)、双子叶植物纲(18.03％)和金藻纲(3.36％)为主.由此可见青海湖裸鲤主要食物组成为真藓类、硅藻类、双子叶植物类、金藻类、丝足虫类、轮虫类及未确定分类的物种.综上所述,青海湖裸鲤的肠道组织结构具有特异性和杂食性鱼类肠道结构的共性,且DNA宏条形码食性分析结果也证实青海湖裸鲤属于杂食性鱼类,其中还有许多未知种类的食物.研究阐明了青海湖裸鲤肠道结构和食性的特点,为青海湖裸鲤的人工繁育和进一步保护提供了基础的科学依据.

CYP17a2 基因是细胞色素CYP17 (cytochrome P450, CYP)超家族成员之一,在卵巢发育过程中,可以与CYP17a1 共同作用控制卵子的发育和成熟.研究和掌握青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)卵巢发育的基本规律,可为该鱼种的人工增殖放流及其资源保护和恢复提供技术支撑.本研究采用普通PCR 和 RACE 方法克隆得到了青海湖裸鲤CYP17a2 基因全长cDNA 序列,并分析了其生物信息学意义,通过实时荧光定量PCR 确定了CYP17a2 基因在青海湖雌性裸鲤各组织中的表达分布特征.该基因的cDNA 序列全长为1 871 bp,共编码390个氨基酸,所编码的氨基酸序列与斑马鱼和鲤鱼的同源性最高,分别为69％和64％.该基因在卵巢、卵巢膜、脑、肌肉、肝胰脏中均有表达,以在卵巢中表达量最高(p＜0.01).本研究结果将为进一步开展CYP17a2 基因在青海湖裸鲤卵巢发育的分子调节机理的研究中提供基础数据.

为探讨不同裂腹鱼类感染多子小瓜虫后的病理学差异,利用多子小瓜虫对青海湖裸鲤指名亚种(Gymnocypris przewalskii przewalskii)和黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi Kessler)实施感染实验,并对2种鱼进行了深入的病理学研究.研究结果显示:(1)2种鱼的死亡量均呈现先激增后明显回落的趋势,青海湖裸鲤死亡高峰在感染后第3至第4天,黄河裸裂尻鱼死亡高峰在第3至第5天,青海湖裸鲤的死亡比黄河裸裂尻鱼急剧.(2)感染后2种鱼体表均出现大量肉眼可见的白点.青海湖裸鲤皮肤黏液分泌量明显增加,体表形成胶状黏液层,黏液层中见不同细胞期小瓜虫包囊.黄河裸裂尻鱼鳍出现蛀鳍现象,皮肤出现细菌感染样溃烂.(3)解剖发现,感染组青海湖裸鲤和黄河裸裂尻鱼肝脏发生病理改变呈淡黄色,胆有不同程度肿大.(4)组织切片和电镜观察显示,小瓜虫在鳃部位的寄生导致青海湖裸鲤和黄河裸裂尻鱼鳃丝黏连,鳃小片和鳃丝上皮细胞萎缩、脱落,鳃丝结构被严重破坏.小瓜虫在2种鱼皮肤的寄生使寄生部位组织突起,周围组织塌陷.青海湖裸鲤表皮下层出现空隙,表皮结构被严重破坏.黄河裸裂尻鱼皮肤表皮细胞出现空泡化病理改变,失去原有紧密结构,表皮层和固有层间界限变模糊.综上所述,小瓜虫的感染对青海湖裸鲤和黄河裸裂尻鱼的鳃和皮肤组织造成严重损伤,但2种鱼表现的症状和造成的组织损伤类型有明显差异,这与2种鱼长期适应不同水体环境密切相关.

目的 本试验旨在观察和分析青海湖裸鲤的不同发育时期胚胎促甲状腺激素释放激素(thyrotropin-releasing hormone)TRH基因的表达情况.方法 提取青海湖裸鲤的总RNA制备地高辛标记的反义TRH基因的mRNA探针,用体视显微镜观察原位杂交的TRH基因表达情况.结果 显微观察显示青海湖裸鲤胚胎发育第6～8天在间脑出现了TRH基因的阳性杂交信号;第9～11天的胚胎的间脑、中脑、后脑和髓脑多处出现阳性杂交信号,间脑的表达量比其他脑组织的表达量高.结论 原位杂交表明THR基因在青海湖裸鲤6～11 d胚胎中表达,提示促甲状腺激素释放激素可能对青海湖裸鲤脑部的发育和成熟有重要的作用.

AP-1是细胞增殖和分化的重要转录因子,在动物免疫、发育等方面发挥着重要作用.本研究采用RACE方法克隆了青海湖裸鲤AP-1基因的cDNA全长序列,通过实时荧光定量PCR探究了其在不同组织中的表达情况.结果 显示,青海湖裸鲤AP-1的cDNA序列全长为1 832 bp,CDS区918 bp,共编码305个氨基酸,预测该蛋白的分子量为33.69 kD,等电点9.20.系统进化结果显示青海湖裸鲤与犀角金线鲃有较高的同源性.蛋白结构预测显示该基因编码的蛋白C端具有一个典型的碱性区和一个高度保守的亮氨酸拉链结构,该结构能与DNA相结合.qRT-PCR结果表明,AP-1基因在肌肉、肝脏、鳃、心、肾、脑、肠和脾脏中均有表达.在肌肉中具有最高表达量(p＜0.01),其次为肝脏和鳃(p＜0.01),在脾脏中表达量最低.本研究为进一步了解青海湖裸鲤AP-1基因的功能提供了数据基础.

白细胞介素-8 (interleukin-8,IL-8)是一种CXC家族趋化因子,主要通过趋化炎症细胞参与机体免疫反应.本研究通过RT-PCR技术,扩增得到含一对酶切位点的青海湖裸鲤IL-8成熟蛋白DNA序列(gpIL-8),经酶切连接至pET30a(+)质粒得到原核表达重组质粒pET30a-gpIL-8,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21后成功诱导得到分子量约13.7 kD的重组蛋白,重组蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在.通过对影响蛋白表达量的诱导物浓度和诱导时间进行优化,发现包涵体重组蛋白表达量随诱导时间增加而增加,随诱导物浓度增加呈先增加后减少的趋势,在0.4 mmol/L IPTG诱导8h时表达量最高.可溶性重组蛋白表达量总体上随诱导时间的增加呈先增加后减少趋势,随诱导物浓度的增加表达量无明显改变,在0.4 mmol/LIPTG诱导6h时即可表达高浓度的可溶性重组蛋白.因可溶性蛋白有利于后续实验,故利用最佳诱导条件诱导后对可溶性蛋白进行纯化,得到高纯度的IL-8重组蛋白,测得浓度达101.5 μg/mL,满足后续实验要求.本研究为青海湖裸鲤IL-8多克隆抗体制备,及其功能、作用机制研究提供了理论依据.

研究通过人工产卵环境模拟,成功诱导青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)自然产卵受精,通过标志跟踪和视频监控等方法对青海湖裸鲤的繁殖行为进行了研究.结果 表明,青海湖裸鲤的繁殖过程包含了追逐、伴游、潜尾、溅戏和交尾等典型行为.其中溅戏行为(单尾雌鱼或雄鱼背鳍露出水面并用尾部拍击水面)首次被观察确认,常被误认为是交配行为.追逐、伴游、潜尾和溅戏等繁殖行为平均频次分别为:5.7、14.7、9.3和3.5次/d.通过采用不同性比重复配对实验发现,在观测到的34次交配行为中,32次(94.1％)均为1雌和1雄配对交配.研究还发现性成熟的雌性青海湖裸鲤为一次产卵类型,短时间内多次交尾排卵,雌雄交配(排卵授精)行为约每天3-9次,每次排卵耗时约4-9s,每次平均排卵量131粒(范围15-376),每尾雌鱼可连续交配产卵3-7d.观测到34次的交配行为中,31次(91.1％)均发生在夜间(23:00--次日2:00),3次(8.9％)发生在白天(早晨6:00-7:00).研究首次基于人工模拟产卵环境观察描述了青海湖裸鲤的繁殖行为特征,可为青海湖裸鲤人工产卵场构建、自然繁殖监测和产卵场保护提供科学依据.

为了掌握青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalksii)资源补充状况,于2019年5月26日至9月2日逐日在青海湖第二大支流沙柳河开展了青海湖裸鲤早期资源丰度时空变化特征的调查研究,共采集青海湖裸鲤鱼卵3386粒,仔鱼4690尾.调查发现,亲鱼自5月底开始洄游,鱼卵6月初出现,6月底至7月初达到高峰,随后逐渐下降,至8月中旬基本消失.仔鱼数量自7月初呈波动式上升,8月达到高峰,9月初逐渐消失.经估算,沙柳河鱼卵径流量为25.58×106粒,仔鱼径流量为62.00×106尾.鱼卵仔鱼空间分布为从河口往上丰度依次递减,断面水平分布为右岸>左岸>中心.Kruskal-Wallis检验表明,昼夜鱼卵丰度存在显著差异(P<0.05);昼夜仔鱼丰度存在极显著性差异(P<0.01),鱼卵仔鱼漂流高峰期均集中在夜间.鱼卵丰度与流速呈显著正相关(P<0.05),仔鱼丰度与流速呈极显著正相关(P<0.01),与径流量日上涨率呈极显著正相关(P<0.01).研究报道了沙柳河青海湖裸鲤早期资源现状,填补了该水域青海湖裸鲤早期资源研究的空缺,为青海湖裸鲤上溯亲本资源量和入湖幼鱼资源量估算提供了数据支撑,可为青海湖裸鲤资源管理与保护提供科学依据.