目的:构建雌激素受体α配体结合域(ERα-LBD)表达载体，优化表达条件得到可溶性ERα-LBD蛋白。方法:在Addgene网站检索关键词ESR(雌激素受体，estrogen receptor)，选择符合条件的质粒载体pcDNA-HA-ER WT(Addgene plasmid # 49498; http：//n2t.net/addgene：49498; RRID：Addgene_49498)，设计引物并扩增得到目的片段ERα-LBD，分别构建蛋白表达载体pET-28a-LBD和pGEX-4T1-LBD，改变诱导温度、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)浓度以及诱导时间对表达条件优化。待细菌裂解并提取蛋白后进行凝胶电泳，可在细菌上清的泳道中观察到明显的紫色蛋白表达条带，即为可溶性ERα-LBD蛋白。结果:pET-28a-LBD重组质粒未能表达重组蛋白ERα-LBD，重组质粒pGEX-4T1-LBD在Rosetta和BL21(DE3)感受态中以1 mmol/L IPTG诱导仅能得到包涵体；以0.2 mmol/L IPTG 16 ℃过夜诱导培养，则可得到可溶性ERα-LBD蛋白。结论:成功构建ERα-LBD表达载体并优化诱导表达条件，获得可溶性ERα-LBD蛋白。

目的:比较米库氯铵和苯磺顺阿曲库铵在激光喉显微手术中的麻醉效果，为进一步优化肌松方案提供临床依据。方法:选择2021年10月至2022年1月首都医科大学附属北京同仁医院择期拟行全身麻醉下激光喉显微手术的患者56例。年龄18~65岁，男25例，女31例，采用随机数字表法分为两组（ n=28）。苯磺顺阿曲库铵组（C组）：苯磺顺阿曲库铵0.1 mg/kg诱导，生理盐水术中持续输注；米库氯铵组（M组）：米库氯铵0.25 mg/kg诱导，0.3 mg·kg -1·h -1术中持续输注。比较两组患者的插管时间、拔管时间、恢复指数、Cooper′s 气管插管评分、C-L喉镜暴露分级、手术条件分级、术后肌松残余、过敏相关不良事件等。 结果:M组患者的插管时间和拔管时间分别为（3.7±1.1）、（16.2±5.0）min，短于C组的（4.9±0.7）、（26.4±8.6）min（均 P<0.05）；M组和C组患者的恢复指数分别为（4.5±3.4）、（6.2±5.0）min，Cooper′s 评分［ M（ Q1， Q3）］均为9（9，9）分，C-L喉镜暴露分级均为Ⅰ级，手术条件分级比例（良/优）分别为5/23、0/28，差异均无统计学意义（均 P>0.05）；M组患者在麻醉后监测治疗室（PACU）的四个成串刺激（TOF）值为（95.7±2.6）%，高于C组的（92.9±3.9）%（ P=0.015）；两组患者在不同时间点的平均动脉压、心率比较差异均无统计学意义（均 P>0.05）。M组和C组患者皮肤潮红发生率分别为10.7%（3/28）、0，差异无统计学意义（ P=0.074）；两组患者均未发生严重低血压、气道压显著升高或气道痉挛。 结论:在激光喉显微手术中，米库氯铵比苯磺顺阿曲库铵的插管时间、拔管时间更短，血流动力学平稳，过敏相关不良事件未见明显增加，安全有效。

目的:制备抗B组柯萨奇病毒(Coxsackievirus，CVB)3C蛋白的多克隆抗体。方法:通过聚合酶链式反应从pcDNA3.1(+)-EGFP-3C中扩增编码3C的DNA片段，构建pET28a(+)-3C-6His表达载体，转化至大肠埃希菌(Escherichia coli， E. Coli)BL21(DE3)以表达3C重组蛋白。优化表达条件及菌体蛋白的提取方法，经超声破碎制备菌体总蛋白，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)后，用氯化钾进行胶染色，切胶回收相对分子质量为26 000的蛋白，即纯化的3C重组蛋白(3C-6His的相对分子质量为26 000)。用纯化的1 mg 3C重组蛋白加等量弗氏佐剂免疫新西兰大白兔，共免疫5次，每次间隔1周，免疫结束后1周取兔血清，检测抗体的特异性。 结果:在相对分子质量为26 000的位置检测到了3C-6His融合蛋白的表达，成功构建了高效表达带His标签的3C重组蛋白载体。重组3C蛋白原核优化表达条件为37 ℃培养细菌6 h，加0.05 mmol/L异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG)进行诱导。经SDS-PAGE分离菌体总蛋白，得到了纯化的3C重组蛋白。获得的兔免疫血清可以结合 E. Coli及HeLa细胞表达的3C蛋白，还能识别感染CVB3或肠道病毒A71的HeLa细胞中表达的3C蛋白。 结论:获得了抗CVB3 3C蛋白酶的多克隆抗体，这一抗体可特异结合肠道病毒的3C蛋白酶，为进一步研究3C蛋白酶在肠道病毒致病机制中的作用奠定了基础。

目的:通过蛋白重组技术低成本、快速制备高浓度人视黄醇结合蛋白4（hRBP4）参考物质，解决临床hRBP4高值参考物质难以获取的需求。方法:在美国国立生物技术信息中心NCB查找hRBP4的互补DNA序列，经大肠埃希菌密码子优化后人工合成，然后将DNA片段克隆至原核表达质粒pET-28a（+）中，以构建重组hRBP4表达载体。将重组质粒转化至 E. coli BL21感受肽中，优化诱导表达条件（如温度、转速和异丙基硫代半乳糖苷IPTG浓度等）、诱导质粒表达并对重组蛋白进行His融合标签纯化，获取纯化后的hRBP4重组蛋白。 结果:DNAMAN软件对比显示编码hRBP4蛋白的碱基序列完全正确，成功构建重组hRBP4原核表达质粒；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示亲和纯化产物中可清晰可见约相对分子质量26 000电泳条带；临床尿液和血清hRBP4常规检测系统均可检测到纯化的hRBP4蛋白，且稀释倍数与检测浓度间呈现良好线性关系。结论:成功构建重组hRBP4高水平表达系统，重组hRBP4蛋白纯度大、浓度高、生产周期短，有望在室间质量评价质控品和有证参考物质研制中发挥重要作用。

目的:制备和鉴定抗CD47胞外区蛋白多克隆抗体。方法:通过逆转录PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)扩增CD47分子胞外区基因序列，分别重组到原核表达载体pET32a(＋)和pET31b(＋)中，利用大肠杆菌表达CD47蛋白，并优化异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导蛋白表达工艺，表达出CD47蛋白。用纯化的CD47蛋白免疫Balb/c小鼠，获得小鼠多克隆抗体，使用亲和层析法纯化CD47多抗，并对多抗进行酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA )效价检测和Western blot特异性鉴定。结果:成功构建pET32a(＋)-CD47和pET31b(＋)-CD47重组质粒。按照实验设置不同条件诱导表达蛋白后，选出最佳表达载体pET32a(＋)-CD47。在大肠杆菌中获得表达最佳蛋白表达工艺。表达制备CD47蛋白，经过五次免疫后，得到CD47多抗。用ELISA法检测制备多抗的效价能达到1∶128 000。Western blot检测结果显示，自制的CD47多抗能准确检测出小鼠心脏组织样品。结论:成功制备了CD47胞外区蛋白多抗，为进一步研究CD47生物学功能奠定了基础。

目的:利用毕赤酵母高效表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域(receptor binding domain，RBD)，并评估以该RBD蛋白作为抗原所制备的疫苗组合物的免疫原性。方法:选取RBD蛋白并合成对应基因片段，将其构建至pPICZαA质粒，质粒经线性化转化后整合到毕赤酵母基因组中进行重组表达。Western blot和基于BLI(Biolayer Interferometry)技术的定量分析方法对培养上清中RBD蛋白进行检测，筛选能够分泌表达RBD蛋白的单克隆菌株。通过优化发酵工艺，包括培养基的盐浓度调整和诱导条件优化(pH、温度和时间等参数)，实现RBD蛋白的高效表达，并在小鼠体内评估其免疫原性。结果:筛选获得重组RBD蛋白表达效果较好的RBD-X33单克隆菌株。通过优化后的发酵工艺，即采用HBSM培养基、诱导pH为6.5±0.3、诱导温度为22℃、诱导时间持续120 h，实现发酵收获上清中重组RBD的表达量达到240 mg/L。在小鼠免疫原性试验中，采用铝+CpG双佐剂系统吸附重组RBD蛋白的疫苗组合物能够激发小鼠产生2.7×10 6结合抗体滴度和726.8活病毒(野生型)中和抗体滴度。 结论:采用毕赤酵母表达系统能够高效表达重组RBD蛋白，且所表达的RBD蛋白能够有效激发动物产生免疫应答。本研究为基于RBD蛋白的重组新型冠状病毒疫苗的开发提供了参考。

目的:诺如病毒（norovirus，NoV）是导致人类急性胃肠炎的主要病原体之一，目前仍没有获批上市的NoV疫苗，开发安全有效且便于推广的NoV疫苗具有重要意义。本研究基于乳酸菌表达系统构建在体外表达GⅡ.2型人诺如病毒（human norovirus，HuNoV）主要衣壳蛋白（viral protein 1，VP1）的重组乳酸乳球菌，并评价其诱导机体产生黏膜免疫和体液免疫的能力。方法:将HuNoV GⅡ.2型VP1基因片段无缝克隆至乳酸菌表达系统中，体外诱导表达目的蛋白VP1，并通过正交试验优化蛋白表达条件。对小鼠进行口服免疫后通过ELISA方法测定其血清和组织中的免疫因子水平。结果:构建了一株针对HuNoV GⅡ.2型的新型重组乳酸乳球菌疫苗，口服免疫后可诱导小鼠产生NoV特异性IgG和IgA，并诱导产生黏膜免疫系统的主要效应分子sIgA。结论:本研究构建的口服乳酸菌疫苗能够诱导小鼠产生针对NoV的先天性和获得性免疫，并产生对应的免疫分子。与被广泛用于研究的病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）疫苗相比，此口服疫苗还具有制备快捷、成本更低、运输方便的优势。

目的:对2019新型冠状病毒(2019-novel Coronavirus，2019-nCoV)核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，NP)进行原核表达、纯化与鉴定，并应用于2019-nCoV血清学诊断。方法:合成2019-nCoV NP基因，克隆至pET28a载体中，构建表达质粒，并进行诱导纯化。纯化蛋白经SDS-PAGE、间接ELISA、Western blot(WB)、免疫层析法进行鉴定。优化间接ELISA反应条件，进行血清抗体检测。结果:重组NP经镍柱纯化后SDS-PAGE电泳显示相对分子质量约50×10 3，与预期一致；间接ELISA、WB表明其能与2019-nCoV感染患者血清特异性结合；用免疫层析法发现对NP检测限为0.2 ng/ml；间接ELISA检测32份2019-nCoV感染者血清及对照血清，发现二者结果可见明显分群。 结论:原核表达的NP具有良好的免疫原性，可用于制备血清学诊断试剂。

目的:建立用于人呼吸道合胞病毒（HRSV）中和抗体滴度检测的噬斑减少中和实验（PRNT），并进行条件优化与初步应用。方法:应用CHO表达系统制备帕利珠单克隆抗体（Palivizumab），同时对细胞种类、细胞培养时间、固定通透方法、封闭方法等影响因素进行优化。验证该方法的重复性，并与传统PRNT验证其相关性。利用优化的PRNT方法检测BALB/c小鼠血清（融合蛋白肌肉注射免疫）对HRSV A和B亚型的中和抗体滴度。结果:Palivizumab的表达量约为50 mg/L。PRNT的最佳工作条件为：培养细胞为HEp-2细胞，细胞培养时间为2 d，最佳固定通透方式为4%（V/V）多聚甲醛室温固定15 min后0.2%（V/V）Triton X-100通透15 min，去掉封闭步骤。优化后该方法的重复性验证总体变异系数均<15%，与传统PRNT呈现良好的线性关系，Spearman相关系数 r s高达0.983。在检测小鼠血清对HRSV A亚型long株和B亚型9320株的中和抗体滴度时，融合蛋白联合AlOH和CpG佐剂诱导小鼠产生的中和抗体滴度最高。 结论:本研究建立的HRSV中和抗体检测方法快速、可重复、高通量，能够适用于A、B亚型HRSV的中和抗体检测。

目的:构建人降钙素原（hPCT）原核表达载体，低成本、快速、高浓度、高纯度获取hPCT纯化蛋白，为临床实验室检测制备质控品和参考物质奠定基础。方法:将GenBank提供的hPCT编码序列经大肠杆菌密码子优化后，人工合成DNA片段克隆至pET-28a(+)原核表达载体以构建重组hPCT表达质粒。转化至大肠杆菌 E. coli BL21感受态中，优化诱导表达条件、诱导质粒表达并对重组蛋白进行His融合标签纯化。 结果:成功构建重组hPCT原核表达质粒，优化异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达浓度及诱导温度，最适IPTG浓度为0.2 mmol/L，最佳诱导温度为37 ℃。纯化后hPCT蛋白可通过临床检测，且稀释倍数与检测浓度间呈现良好线性关系，回归方程为y=-0.0085x+112.63， R2值为0.9975。 结论:成功构建重组hPCT的高效表达系统，重组hPCT蛋白纯度大、浓度高、生产周期短，有成为候选室间质量评价参考物质的潜力。